【成功案例】-人類顳葉皮層circRNA測(cè)序揭示顳葉癲癇的新認(rèn)知

英文名：High-Throughput Data of Circular RNA Profiles in Human Temporal Cortex Tissue Reveals Novel Insights into Temporal Lobe Epilepsy
中文名：人類顳葉皮層組織的circRNA高通量測(cè)序揭示顳葉癲癇的新認(rèn)知
雜志：Cell Physiol Biochem 2018
影響因子：5.104
合作單位：首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院北京神經(jīng)外科研究所

01.研究背景

癲癇是一種常見(jiàn)的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，影響近5000萬(wàn)人，約占世界人口的0.4-1%。顳葉癲癇(TLE)是一種常見(jiàn)的癲癇，伴有藥物抵抗，需要對(duì)癲癇灶進(jìn)行手術(shù)切除。人類的TLE病變包括了在鉤回、杏仁核和側(cè)顳葉皮層的異常，其中許多異常與興奮性離子通道和改變的離子型受體有關(guān)。全基因組表達(dá)譜揭示了在人的TLE組織中，離子通道和相關(guān)受體基因的模式發(fā)生了顯著的改變，但是這些基因表達(dá)如何被調(diào)控仍然未知。
最近的基因組學(xué)研究揭示了許多與各種疾病的基因調(diào)控相關(guān)的非編碼RNA (ncRNAs)。人類癲癇中非編碼RNA的表達(dá)也發(fā)生了改變，可以作為一種新的、非侵入性的生物標(biāo)志物來(lái)改善目前的癲癇診斷。環(huán)狀RNA (circRNAs)是一種獨(dú)特的非編碼環(huán)狀RNA，circRNA與microRNAs (miRNAs)相互作用，并作為miRNA海綿，通過(guò)circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中調(diào)節(jié)基因表達(dá)。研究表明環(huán)狀RNA在神經(jīng)元功能中發(fā)揮重要作用，尤其是在突觸中。組織學(xué)研究結(jié)果證實(shí)，邊緣系統(tǒng)的突觸重組似乎能逐漸增強(qiáng)皮質(zhì)興奮性，并可能導(dǎo)致癲癇發(fā)作。然而，circRNAs在癲癇中的作用仍是未知的。
在本研究中，為了評(píng)估circRNA在人體內(nèi)的作用，作者采用了高通量測(cè)序方法，測(cè)定TLE患者和非TLE患者顳葉新皮質(zhì)中circRNA表達(dá)水平，并對(duì)環(huán)狀RNA的功能進(jìn)行了注釋。作者描述了一個(gè)包含潛在基因與circRNA-miRNA的網(wǎng)絡(luò)。

02.材料方法

試驗(yàn)材料：非TLE對(duì)照組和TLE組患者的顳葉新皮質(zhì)組織
測(cè)序方法：circRNA seq，Illumina HiSeq4000（北京百邁客）

03.研究結(jié)果

1.臨床和病理數(shù)據(jù)
術(shù)中腦電圖（I-EEG）和免疫染色（NeuN和GFAP）結(jié)果表明，相比于非TLE對(duì)照組，TLE組患者具有典型的異常情況。

圖1. I-EEG和免疫染色結(jié)果

2.顳葉皮層circRNA表達(dá)譜
在兩組樣本中檢測(cè)出了78983個(gè)circRNA，15.29%為已知circRNA，84.71%是新發(fā)現(xiàn)的circRNA。其中，58558個(gè)circRNA位于外顯子區(qū)，10520個(gè)位于內(nèi)含子區(qū)，其它位于基因間區(qū)（圖2a），不同類型circRNA的表達(dá)水平如圖2b所示。已知的circRNA整體表達(dá)水平比新circRNA高，外顯子circRNA表達(dá)水平高于內(nèi)含子和基因間區(qū)的circRNA表達(dá)水平。表明樣本中大多數(shù)circRNA位于外顯子區(qū)，并且可能在癲癇中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。
所有circRNA和外顯子circRNA的GC含量高于circRNA數(shù)據(jù)庫(kù)，但內(nèi)含子和基因間區(qū)circRNA的GC含量與circRNA數(shù)據(jù)庫(kù)中相似（圖2c）。此外，circRNA長(zhǎng)度的峰值主要集中在558 bp區(qū)域，而在數(shù)據(jù)庫(kù)中circRNA的峰值則集中在4105 bp區(qū)域。新circRNA與已知的circRNA長(zhǎng)度具有相似的特征，表明新circRNA數(shù)據(jù)是可靠的（圖2d）。圖2e顯示了circRNA在人類染色體上的基因分布，circRNA也廣泛分布于所有的染色體中，但在Y染色體和著絲粒上的分布較少，在每條染色體的染色體臂兩端有較高的分布。

圖2. CircRNA表達(dá)譜

3.CircRNA差異表達(dá)分析及qPCR驗(yàn)證
TLE與對(duì)照樣本之間有442個(gè)顯著差異表達(dá)的circRNA (FC≥2，F(xiàn)DR≤0.05)，其中254個(gè)下調(diào)，188個(gè)上調(diào)（圖3a）。circRNA的來(lái)源基因功能注釋結(jié)果表明，這些差異表達(dá)circRNA可能與GTPase活性、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)和蛋白磷酸化等途徑有關(guān)，這些途徑在癲癇的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。為了找出功能性的差異表達(dá)circRNA，比較了100個(gè)差異表達(dá)最顯著的circRNA和GO數(shù)據(jù)庫(kù)中的5058個(gè)功能基因，從中找到了10個(gè)與神經(jīng)功能相關(guān)的circRNAs 。
作者選擇了10個(gè)顯著差異表達(dá)的circRNA進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，其中有8個(gè)circRNA差異顯著。結(jié)果表明，qPCR試驗(yàn)結(jié)果與高通量測(cè)序結(jié)果基本一致。此外，還選擇了表達(dá)量差異最顯著的兩個(gè)circRNA（circ-EFCAB2、circa-DROSHA），在28個(gè)臨床樣本中進(jìn)行qPCR試驗(yàn)（圖3c），結(jié)果表明這兩個(gè)circRNA在對(duì)照組和TLE組之間顯著差異表達(dá)。綜上所示，發(fā)現(xiàn)了circ-EFCAB2和circ-DROSHA在TLE患者顳葉皮層組織中存在著異常調(diào)節(jié)。circ-EFCAB2和circ-DROSHA的來(lái)源基因分別為EFCAB2和DROSHA。EFCAB基因家族主要選擇性地與鈣離子非共價(jià)作用。EFCAB2上調(diào)會(huì)影響鈣離子的結(jié)合，從而導(dǎo)致癲癇的發(fā)生。DROSHA是一種雙鏈RNA特異內(nèi)切核糖核酸酶，它影響miRNA生物合成的初始階段，其丟失會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)異常、癲癇和神經(jīng)退行性疾病。因此，circ-EFCAB2和circ-DROSHA可能是通過(guò)調(diào)節(jié)EFCAB2和DROSHA參與TLE。

圖3. 差異表達(dá)circRNA及其來(lái)源基因注釋、qPCR驗(yàn)證

4.circRNA作為miRNA海綿參與癲癇發(fā)病的分子機(jī)制
為了確定circ-EFCAB2和circ-DROSHA的功能，利用TargetScan和Miranda來(lái)預(yù)測(cè)靶向miRNA。預(yù)測(cè)結(jié)果表明，circ-EFCAB2的前5個(gè)靶向miRNA分別為miR-5787、mir – 684 -5p、miR-3929、miR-6780a-5p和miR-4739，而circ-DROSHA的靶向miRNA分別為miR-1252-5p、miR-651-3p、miR-4446-5p、miR-548ab和miR-4762-3p。通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)，找到了上述的10個(gè)miRNAs對(duì)應(yīng)的靶基因，構(gòu)建了circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)（圖4）。其中，circ-DROSHA的間接靶基因CLCN6是一種氯離子通道家族（CLCs）成員，它與電興奮性、跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)、電中性和離子穩(wěn)態(tài)等多種生理過(guò)程有關(guān)；而其打分最高的靶向miR-1252-5p所對(duì)應(yīng)的靶基因ATP1A2與癲癇具有很強(qiáng)的相關(guān)性，也是人類癲癇的候選基因。
由于circ-EFCAB2和circ-DROSHA被預(yù)測(cè)為這些miRNA的海綿，它們可能會(huì)吸附這些miRNA而影響靶基因的表達(dá)，從而影響TLE的發(fā)病機(jī)制。

圖4. circ-EFCAB2、circ-DROSHA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

由于circ-EFCAB2和circ-DROSHA被預(yù)測(cè)為這些miRNA的海綿，它們可能會(huì)吸收這些miRNA而影響靶基因的表達(dá)，從而影響TLE的發(fā)病機(jī)制。

總結(jié)

綜上所述，作者對(duì)TLE患者顳葉新皮質(zhì)組織的circRNA表達(dá)譜進(jìn)行了全面的分析，確定了癲癇患者的8個(gè)circRNA。其中顯著差異表達(dá)的circ-EFCAB2和circ-DROSHA可能是通過(guò)調(diào)節(jié)來(lái)源基于EFCAB2和DROSHA參與TLE，也可能作為miRNA的海綿影響靶基因的表達(dá)，參與TLE的發(fā)病機(jī)制（圖5）。

圖5. circ-EFCAB2、circ-DROSHA參與癲癇發(fā)生的分子機(jī)制示意圖

參考文獻(xiàn)：Li J, Lin H, Sun Z, et al. High-Throughput Data of Circular RNA Profiles in Human Temporal Cortex Tissue Reveals Novel Insights into Temporal Lobe Epilepsy[J]. Cellular Physiology and Biochemistry, 2018, 45(2): 677-691.