系統(tǒng)進(jìn)化樹中各個元素的介紹如圖1所示
圖1 進(jìn)化樹的結(jié)構(gòu)示意圖
根據(jù)是否指定了根節(jié)點(diǎn)，系統(tǒng)進(jìn)化樹可以分為有根樹和無根樹。
有根樹指定了根節(jié)點(diǎn)，樹中可以看出各個節(jié)點(diǎn)的距離和祖先節(jié)點(diǎn)以后各個分枝分化的先后關(guān)系，因此可以用于分化時間的推斷；
無根樹沒有指定祖先節(jié)點(diǎn)，只能看出各個節(jié)點(diǎn)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和相對距離。
無根樹和有根樹圖示如圖2。圖2左邊的進(jìn)化樹只看到了材料的聚類關(guān)系和相對距離的遠(yuǎn)近，無法判斷哪個分枝屬于較為古老的分枝，哪個分枝為比較年輕的分枝；而圖2右邊的進(jìn)化樹加了外群，并且把外群指定為根，所以從圖中除了可以看到材料的相對距離以外，還可以可以看到各個分枝材料的分化順序。有根樹根的選擇應(yīng)有所講究，一般選擇所研究的材料（根以下的全部材料）的最近的共同近緣種作為外群。
圖2 無根樹和有根樹[1,2]
隨著測序成本的下降，簡化測序和全基因組重測序在遺傳進(jìn)化中的應(yīng)用變得越來越廣泛，對研究群體進(jìn)行簡化測序或者全基因組重測序獲得的用于分析的標(biāo)記通常為SNP標(biāo)記，有許多研究人員獲得SNP標(biāo)記后，往往不知道如何利用SNP標(biāo)記進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建，腦子往往一直停留在序列比對–修改–構(gòu)建進(jìn)化樹的階段，其實(shí)基于SNP進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建的過程相當(dāng)簡單，每個樣本的每個位點(diǎn)連起來就是一條序列，因?yàn)槊總€樣本的SNP數(shù)目相同，所以比對這一步就可以直接省去了。
下面小編就從VCF開始，告訴大家如何用比較流行的MEGA軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，我們只需要準(zhǔn)備兩個軟件：TASSEL（https://bitbucket.org/tasseladmin/tassel-5-standalone/downloads/?tab=tags）和MEGA7（http://www.megasoftware.net/）即可完成進(jìn)化樹構(gòu)建的全部操作。
VCF轉(zhuǎn)MEGA格式。用TASSEL打開VCF文件，另存為Phylip格式（Save As — ?Phylip(Interleaved)），如圖3，然后用MEGA7把Phylip文件轉(zhuǎn)換成MEGA格式（File — Convert File Format to MEGA — 選擇剛才轉(zhuǎn)出的Phylip文件按提示操作存成.meg文件），轉(zhuǎn)出的格式如圖4，前兩行為文件頭信息，無實(shí)際意義，但是必有。“#33-16”表示樣本編號，與fasta文件的格式不同，mega格式樣本的起始不是“>”而是“#”，接下來便是該樣本的SNP連接成的序列信息。
圖3 使用TASSEL把VCF轉(zhuǎn)為Phylip(Interleaved)格式
圖4 MEGA文件格式
系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建步驟：
1、mega文件導(dǎo)入：
File — Open A File/Session — 選擇要導(dǎo)入的文件，選擇數(shù)據(jù)類型（如果是SNP即為Nuceotide Sequences），提示Protein-coding nucleotide sequence data時，選擇No，即不把DNA序列翻譯成蛋白序列構(gòu)建進(jìn)化樹，如圖5。
圖5 meg文件導(dǎo)入
2、系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建
選Phylogeny選項卡，在可選的方法中選擇一種方法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，種內(nèi)材料一般選擇NJ法即可，屬內(nèi)種間或?qū)僖陨喜牧峡梢杂肕L（maximum likelihood tree）法（ML法計算之前，可進(jìn)行模型的選擇：Models — Find Best DNA/Protein Models，使用選出的模型進(jìn)行ML樹的構(gòu)建），下面以NJ法為例進(jìn)行說明。
參數(shù)設(shè)置，主要填寫B(tài)ootstrap值，一般選擇500或1000次；Model一般用Kimura 2-parameter Model（K2），如果K2模型運(yùn)行不了，可以換成p-distance模型；Gaps/Missing Data Treatment選擇Partial deletion或者pairwise deletion，選擇complete deletion時帶有缺失值的標(biāo)記都會被刪除，所以必須謹(jǐn)慎；Site Coverage Cutoff與我們常說的完整度相同，一般填寫成我們過濾標(biāo)記時使用的完整度，上述參數(shù)設(shè)置完成后，點(diǎn)擊compute即可。（見圖6）
圖6 參數(shù)設(shè)置
進(jìn)化樹的著色
用MEGA完成進(jìn)化樹的構(gòu)建后，可以將結(jié)果保存為nwk格式（File — Export Current Tree(Newick)），保存original樹（推薦）時，既輸出枝長，又輸出bootstrap值，而bootstrap consensus tree則只能輸出bootstrap值。
獲得nwk格式的進(jìn)化樹后，需要對其進(jìn)行展示，以便從直觀上判斷材料間的聚類關(guān)系，界面版的MEGA自帶簡單的展示功能，可以對進(jìn)化樹進(jìn)行展示，但其功能較為簡單，無法滿足著色、添加額外信息等較為個性化的要求。從功能的豐富度來說，iTOL(https://itol.embl.de/)、EvolView(http://www.evolgenius.info/evolview/)、ggtree(https://github.com/GuangchuangYu/ggtree)應(yīng)當(dāng)是功能較為齊全的軟件，其中，ggtree是R軟件包，可以在本地操作，但需要編寫代碼，使用起來并不十分方便。三款軟件中，從操作的簡易度，效果的美觀程度來看，iTOL都是最佳的選擇，下面將以iTOL為例子，說明對進(jìn)化樹結(jié)果的展示方法。
1、打開iTOL主頁以后，選擇上端的Upload選項，出現(xiàn)輸入界面后，可以在Tree text框中粘貼nwk中的內(nèi)容，也可以通過【選擇文件】選項選擇需要展示的進(jìn)化樹，之后點(diǎn)擊Upload即可。
圖7 iTOL上傳文件
2、進(jìn)化樹著色，按照iTOL的要求，填寫一個顏色配置文件，填寫方法如該鏈接的說明https://itol.embl.de/help/colors_styles_template.txt，給末端分枝著色的配置文件填寫如下圖，[2,branch,#984EA3,normal,1]中2為樣本ID，branch表示給樹枝上色，#984EA3為16進(jìn)制顏色代碼，normal表示線條的樣式為正常的實(shí)線，1表示枝條的大小為1，該文件必須以.txt結(jié)尾，填寫完成后，將其拖入進(jìn)化樹的界面即可。
圖8 分枝著色配置文件
3、系統(tǒng)進(jìn)化樹的調(diào)整，導(dǎo)入進(jìn)化樹后，右上角會出現(xiàn)一個control面板，該面板包含【Basic】、【Advanced】、【Datasets】、【Export】三個標(biāo)簽項。常進(jìn)行進(jìn)化樹展示的朋友對【Basic】、【Advanced】和【Export】三個標(biāo)簽項的內(nèi)容和操作應(yīng)當(dāng)熟練掌握。
4、分枝顏色的統(tǒng)一。上面的著色例子只對末端分枝進(jìn)行了著色，有時候，我們需要對某個分枝的樣本進(jìn)行顏色的統(tǒng)一，可以選中該分枝并點(diǎn)擊鼠標(biāo)，在彈出的下拉框中選擇color — set clade color — 選擇想用的顏色或填入對應(yīng)的顏色代碼即可。
圖9 分枝統(tǒng)一著色
5、樹根的指定。選擇需要指定為根的枝點(diǎn)，在彈出的下拉框中選擇Tree structure — Reroot the tree here即可。
圖10 指定樹根
6、編輯確定后，點(diǎn)擊右上邊的Save all changes即保存了當(dāng)前的編輯，編輯完成并保存后，選擇export選項卡，選擇輸出文件的格式，一般選擇svg/pdf等矢量圖格式，Export area務(wù)必選擇Full image。
圖11 保存編輯與輸出
當(dāng)需要輸出帶枝長的進(jìn)化樹時，應(yīng)當(dāng)將樹圖拖動到與標(biāo)尺靠近的位置，避免輸出的圖像中樹圖與標(biāo)尺距離過大。
圖12 拖動進(jìn)化樹使其靠近Tree Scale
至此，基于SNP構(gòu)建并編輯進(jìn)化樹的工作就算基本完成了，如果還想要各種比較炫的效果，可以參照iTOL的幫助文檔進(jìn)行操作，包你能夠獲得一棵華麗麗的進(jìn)化樹。
1.Cheng F, Sun R, Hou X, et al. Subgenome parallel selection is associated with morphotype diversification and convergent crop domestication in Brassica rapa and Brassica oleracea[J]. Nature genetics, 2016, 48(10): 1218.
2.Zhou Z, Jiang Y, Wang Z, et al. Resequencing 302 wild and cultivated accessions identifies genes related to domestication and improvement in soybean[J]. Nature biotechnology, 2015, 33(4): 408.
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