蛋白組研究中的iTRAQ技術(shù)

一萬年太久，只爭朝夕，就讓一個億隨風去吧，新的一年我們不僅餃子要吃飽，文章也要發(fā)表，蛋白組文章來一波~

1.蛋白組研究簡介
蛋白質(zhì)是生理活動的執(zhí)行者，是生命現(xiàn)象的直接體現(xiàn)者，對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究將直接闡明生命在生理或病理條件下的變化機制。對細胞或組織的全蛋白質(zhì)表達譜進行系統(tǒng)分析的蛋白質(zhì)組學，是目前發(fā)展迅速的組學研究之一，已被廣泛用于生長發(fā)育、抗逆性狀改良、免疫互作、藥物作用機制、生物標志物發(fā)現(xiàn)等的研究。
所謂“工欲善其事，必先利其器”，科學研究也一樣，下面就給大家介紹一下已被廣泛應用到蛋白組研究中的iTRAQ技術(shù)。

2.iTRAQ技術(shù)介紹
iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)技術(shù)是由美國應用生物系統(tǒng)公司ABI研發(fā)的一種多肽體外標記技術(shù)。該技術(shù)采用4種或8種同位素的標簽，通過特異性標記多肽的氨基基團，而后進行串聯(lián)質(zhì)譜分析，可同時比較4種或8種不同樣品中蛋白質(zhì)的相對含量或絕對含量。

圖1 iTRAQ技術(shù)簡介

iTRAQ試劑由三部分組成：報告基團；質(zhì)量平衡基團和肽反應標記試劑基團，可形成4種或8種相對分子質(zhì)量均為145的等量異位標簽。

圖2 iTRAQ試劑標記肽段

iTRAQ試劑標記酶解后的肽段，可與氨基酸N端及賴氨酸側(cè)鏈連接的胺標記同重元素(isobaric)。在一級質(zhì)譜圖中，任何一種iTRAQ試劑標記的不同樣本中的同一蛋白質(zhì)表現(xiàn)為相同的質(zhì)荷比。在串聯(lián)質(zhì)譜中，報告基團斷裂下來產(chǎn)生報告離子，根據(jù)報告離子的豐度可獲得樣品間相同肽段的定量信息，再經(jīng)過軟件處理得到蛋白質(zhì)的定量信息。

3.iTRAQ文獻
據(jù)不完全統(tǒng)計，通過iTRAQ技術(shù)進行大規(guī)模蛋白質(zhì)研究，發(fā)表的文章已達到2500+，通過iTRAQ技術(shù)進行蛋白組研究發(fā)表文章，接收率還是非常高的~下面iTRAQ文章簡介來一波~

01 抗逆性狀改良
植物在遇到各種環(huán)境侵害(如高溫、低溫、干旱、高鹽、高滲透壓、臭氧及機械損傷等)時會發(fā)生應激保護措施。這些脅迫可以引起大量的蛋白質(zhì)在種類和表達量上的變化,通過對耐旱能力不同的小麥品系進行定量蛋白質(zhì)組學研究可以了解小麥對脅迫的適應機制。

實驗設計：
小麥抗旱品種Opata，小麥耐旱品種Nesser，兩個品種。
取正常培養(yǎng)及ABA處理條件后的根，共4組。
測序策略：
iTRAQ（三個生物學重復，采用三個iTRAQ4標）、LC-MS/MS、qRT-PCR。
研究結(jié)果：
1、利用iTRAQ方法共鑒定出1656個蛋白，其中936個為顯著差異蛋白。
2、從差異分析結(jié)果中，篩選出抗旱能力不同的小麥中特有蛋白（同時對ABA處理有響應）；通過qRT-PCR的方法進行驗證。
文章亮點：
除了對相同作物不同品系與處理條件進行的蛋白組比較研究，本研究的小麥蛋白組數(shù)據(jù)庫采用多個不同的小麥數(shù)據(jù)庫，極大提升了蛋白鑒定數(shù)量。

02 動物生長發(fā)育
豬肉的生長速率和肉質(zhì)是其重要的兩個經(jīng)濟學指標，由多種基因和生物學通路調(diào)控，通過蛋白組學研究可以充分了解動物生長發(fā)育相關(guān)蛋白，為品質(zhì)改良打下基礎。

實驗設計：
中國本土品種：藏豬（TP）、滇南小耳豬（DSP）。
西方引進品種：約克豬（YY）和長白豬（LL）的背最長肌樣本。六月齡取樣，以尋找參與豬肌肉生長和脂肪沉積的關(guān)鍵蛋白。
測序策略：
iTRAQ（兩個生物學重復，采用一個iTRAQ8標）、LC-MS/MS、PRM分析技術(shù)。
研究結(jié)果：
作者應用iTRAQ對四組樣本進行蛋白質(zhì)組學分析，鑒定出了4815個多肽，對應969種蛋白。在這之中有288種為差異性表達蛋白（DEPs），其中169種蛋白在TP-DSP組上調(diào)，119種下調(diào)。
作者隨即對這些DEPs分別進行了GO和KEGG分析，篩選出了28種與肌肉生長相關(guān)和15種與脂肪沉積相關(guān)的蛋白。
文章亮點：
本文最后應用PRM對iTRAQ的分析結(jié)果進行驗證，由于此方法需要目標蛋白有樣本中唯一的多肽作為標記，因此只對其中的12種蛋白進行了PRM分析，結(jié)果均與iTRAQ一致，提高了實驗結(jié)果的可信度。

03 免疫互作
玉米作為世界范圍內(nèi)主要作物,受昆蟲攻擊造成巨大的生產(chǎn)損失。文章旨在研究玉米受食草昆蟲攻擊的響應機制，著重分析與機械損傷相比，食草昆蟲的口腔分泌物對植物-昆蟲之間互作所起的作用。

實驗設計：
W組：未處理的玉米葉片；W+W組：20 μL水處理V3期玉米機械損傷的葉片；
W+OS 組：20μL口腔分泌液處理V3期玉米機械損傷的葉片。
測序策略：
轉(zhuǎn)錄組測序（三個生物學重復）：W+W組和W+OS 組，處理1.5h、6h。
iTRAQ蛋白定量技術(shù)（三個生物學重復）。
靶向代謝組：激素表達水平檢測，篩選測序時間點；非靶向代謝組。
研究結(jié)果：
4406個差異表達的基因中，4142個基因沒有檢測到相應的蛋白表達，只有64個基因在蛋白水平上有明顯變化。差異表達的蛋白有294個，其中214個在轉(zhuǎn)錄水平上沒有顯著差異，推測這些蛋白很可能存在轉(zhuǎn)錄后修飾。
文章亮點：
文章利用多組學（轉(zhuǎn)錄組學、蛋白組學、代謝組學）技術(shù)聯(lián)合分析玉米受植食昆蟲攻擊后的響應機制，并構(gòu)建繪制了系統(tǒng)的調(diào)控模型。這些數(shù)據(jù)對玉米防御昆蟲災害的進一步遺傳學研究搭建了很好的框架，也為抗昆蟲災害的玉米新品種的培育奠定了良好的基礎。

4.轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)構(gòu)建蛋白庫

廣大人民群眾喜聞樂見的餃子餡料，比如韭菜、茴香和大白菜等，至今還基本沒有進行蛋白組研究。作為百合科植物，韭菜的基因組較大，至今都沒有其基因組信息發(fā)表出來，公共數(shù)據(jù)庫中的信息也很少，所以關(guān)于韭菜的基因檢測研究一直都是個空白。
類似韭菜這種研究結(jié)果比較少的物種，可以采用轉(zhuǎn)錄組+蛋白組的測序方式，用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)構(gòu)建蛋白組數(shù)據(jù)庫，后期進行蛋白的定性及定量，對蛋白鑒定數(shù)量的提升也有很大助力。

參考文獻
[1]Wang Z, Peng S, Li Q, et al. iTRAQ-based proteomic analysis reveals key proteins affecting muscle growth and lipid deposition in pigs[J]. Sci Rep, 2017, 7:46717.
[2]Alvarez S, Choudhury S R, Pandey S. Comparative Quantitative Proteomics Analysis of the ABA Response of Roots of Drought-Sensitive and Drought-Tolerant Wheat Varieties Identifies Proteomic Signatures of Drought Adaptability[J]. Journal of Proteome Research, 2014, 13(3):1688-701.
[3]Qi J, Sun G, Wang L, et al. Oral secretions from Mythimna separata insects specifically induce defense responses in maize as revealed by high-dimensional biological data[J]. Plant, 2016, 39(8):1749.

轉(zhuǎn)錄調(diào)控事業(yè)部 小 張丨文案
吳戈宇 | 審核
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