實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Real-time Quantitative PCR,qPCR)是指在PCR反應(yīng)體系中加入可與DNA產(chǎn)物特異性結(jié)合的熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,最終通過(guò)相對(duì)定量或絕對(duì)定量的方法確定各個(gè)樣本的本底表達(dá)量。微生物QPCR可用于快速、準(zhǔn)確地測(cè)定目標(biāo)微生物數(shù)量。
真核生物常見(jiàn)內(nèi)參:18S rRNA、β-actin、GAPDH、EF-1α等;原核生物:16S rRNA、gyrB等。如果無(wú)法確定內(nèi)參,建議參考文獻(xiàn),或者做內(nèi)參篩選實(shí)驗(yàn)。
引物和探針的選擇需要考慮到目標(biāo)微生物的特異性和保守性??梢允褂霉_(kāi)可獲得的微生物基因數(shù)據(jù)庫(kù),如NCBI,進(jìn)行引物和探針設(shè)計(jì)。此外,確保引物和探針的互補(bǔ)性和避免引物之間的重疊和相互作用也很重要。