研究背景

大白菜是一種重要的結(jié)葉蔬菜作物。在抽穗期，葉片內(nèi)外表現(xiàn)出明顯的形態(tài)分化。然而，這種復(fù)雜的葉片形態(tài)分化的遺傳控制仍不清楚。

研究目的

在此，作者研究了抽穗期連續(xù)的頭葉從內(nèi)到外的轉(zhuǎn)錄組譜，通過在24個(gè)不同的葉片組織中展示了全基因組基因表達(dá)的序列-空間剖面，確定了可能在葉片抽穗中發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵過渡頭葉片，為葉狀頭部的形成提供新見解。

材料方法

在溫室盆栽大白菜，使用11周大的植物進(jìn)行取樣。隨機(jī)選擇兩個(gè)正常生長(zhǎng)的大白菜。從外葉到內(nèi)葉的所有頭葉（葉長(zhǎng)>2cm）按順序分離收集，而帶有莖尖分生組織(SAM）的幼葉和小內(nèi)葉（葉長(zhǎng)<2cm）不分離，按順序收集。從每個(gè)大白菜頭部共得到30片葉子。從內(nèi)到外，每3片形態(tài)相似、大小相近的葉子為一葉輪，共得到10葉輪葉。

從每輪葉片中選取一片葉子，命名為L(zhǎng)1-L10，選擇SAM、L1、L2、L3、L5、L7和L9進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。對(duì)于RNA-seq，L2被分為兩部分，葉柄(L2R2）和葉片(L2R1），對(duì)于L3、L5、L7和L9，則分為五個(gè)區(qū)域，包括頂部(R1）、外緣(R2）、葉片的中部區(qū)域(R3）、葉柄的頂部(R4）和中部(R5）區(qū)域進(jìn)行采樣。對(duì)來自兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)（兩個(gè)葉頭）共計(jì)48個(gè)樣品用Illumina平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

圖1. 跨越11個(gè)葉子層的葉子的代表性圖片

研究結(jié)果

1、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

對(duì)48個(gè)樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共產(chǎn)生7.43×108高質(zhì)量cleanreads，皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.92-0.99，所有生物學(xué)重復(fù)都高度相關(guān)。將cleanread與大白菜參考基因組進(jìn)行比對(duì)，計(jì)算基因表達(dá)量TPM值，共鑒定出27,876個(gè)基因。其中，75.08%的基因在所有樣品中都有表達(dá)。

主成分分析(PCA）顯示沿主成分(PC）1和2有明顯的分離。PC1根據(jù)與SAM的距離將葉片樣本分開，而PC2將葉片和葉柄組織分開。層次聚類分析將樣本分為五類，與葉子形態(tài)分化一致。SAM和L1的樣本形成內(nèi)葉1(IL1）最接近莖尖的組織。內(nèi)葉2的葉片（IL2B）和內(nèi)葉2的葉柄（IL2P）代表L2-L5的葉片和葉柄組織，而外葉（OLB）和外葉柄（OLP）代表L2-L5的葉片和葉柄組織外葉（L7和L9），與葉子形態(tài)分化一致。

圖2. 抽穗期不同葉層大白菜葉片的轉(zhuǎn)錄組分析

2、差異表達(dá)基因分析

作者在全基因組水平上鑒定了不同葉片中的差異表達(dá)基因（DEG），以探索葉片之間的多樣性和潛在功能。通過分析，共發(fā)現(xiàn)9,133DEG，k-means聚類將差異基因分為14個(gè)共表達(dá)簇(CEC1-CEC14），這些CEC與圖1中的5個(gè)聚類簇緊密相關(guān)。IL1中DEGs的高表達(dá)水平以CEC1和2為代表。CEC1在SAM中高度表達(dá)，并以與分生組織發(fā)育、組織發(fā)育和近軸/遠(yuǎn)軸極性相關(guān)的基因?yàn)榇?。CEC2在SAM和L1高表達(dá)，包含與細(xì)胞分裂、細(xì)胞增殖、細(xì)胞生長(zhǎng)和生長(zhǎng)素生物合成過程相關(guān)的基因。IL2B中DEG的高表達(dá)水平以CEC4-6為代表。CEC4、5和6均富集于有機(jī)酸代謝過程、淀粉代謝過程、質(zhì)體組織和硫苷代謝、光合光反應(yīng)等過程。IL2P中DEGs的高表達(dá)以CEC9為代表。CEC9富含植物細(xì)胞壁相關(guān)過程，包括壁組織或生物發(fā)生，以及果膠代謝過程。OLB中DEGs以CEC7和8為代表。CEC7在L7葉片中高表達(dá)，并以與蛋白質(zhì)修飾過程、蛋白質(zhì)磷酸化和蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性相關(guān)的基因?yàn)榇怼＿@些結(jié)果反映L7具有明顯的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因調(diào)控特征。CEC8在L9葉片中高表達(dá)，含有一組與葉綠素分解代謝過程、細(xì)胞分解代謝過程、防御反應(yīng)調(diào)節(jié)、果糖反應(yīng)和脫落酸激活信號(hào)通路相關(guān)的基因。OLP中DEG的高表達(dá)水平以CEC11和12為代表。CEC11中的基因在L7-L9的葉柄中高度表達(dá)，在任何基因本體(GO）術(shù)語中均未富集。CEC12中的基因在L9的葉柄中高度表達(dá)。這些基因可能主要參與脫落酸激活的信號(hào)通路、茉莉酸（JA）代謝過程、JA反應(yīng)、防御反應(yīng)、生物刺激反應(yīng)、水楊酸反應(yīng)和外部刺激反應(yīng)。這些結(jié)果表明，L9可能在保護(hù)多葉頭部免受外部損害方面發(fā)揮作用。

圖3.差異基因在不同葉子中的表達(dá)譜

3、葉片發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)揭示葉球形成中的關(guān)鍵過渡葉

作者鑒定了細(xì)胞增殖相關(guān)基因和細(xì)胞擴(kuò)張相關(guān)基因。結(jié)果表明，大多數(shù)細(xì)胞增殖基因在IL1HLs中達(dá)到峰值，包括SAM和L1，但在IL2HLs和外HLs中迅速下調(diào)(圖3A），表明細(xì)胞增殖基因在不斷生長(zhǎng)的內(nèi)葉的起始過程中發(fā)揮重要作用。與細(xì)胞增殖基因不同，大部分細(xì)胞擴(kuò)張基因在IL2HLs和外HLs的葉片區(qū)域高表達(dá)，且表達(dá)模式更為多樣，分為4個(gè)簇(圖3A）。此外，大部分細(xì)胞擴(kuò)張基因在IL2HLs和外層HLs之間表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式，導(dǎo)致L7細(xì)胞分裂和細(xì)胞擴(kuò)張調(diào)控的變化明顯高于IL2HLs和外層葉(圖3B）。

圖4. 細(xì)胞增殖和細(xì)胞擴(kuò)增基因的表達(dá)模式

大白菜HLs的彎曲通常被認(rèn)為是由葉片正軸和背軸之間的不對(duì)稱細(xì)胞生長(zhǎng)引起的。通過分析ad-ab極性基因的表達(dá)模式，以探究ad-ab極性基因在頭葉曲率中的作用。結(jié)果表明，與內(nèi)部HL相比，大多數(shù)ad-ab極性基因在外部HL中顯示出顯著不同的表達(dá)模式。

圖5.?ad-ab極性基因的表達(dá)譜。

通過形態(tài)學(xué)觀察、PCA和聚類分析，以及與細(xì)胞分裂/擴(kuò)張和ad-ab極性相關(guān)的基因表達(dá)，L7位于內(nèi)葉和外葉之間的邊界。作者通過主成分分析和聚類將L7分類為外葉組，最終確定L7是顯示三種模式的過渡狀態(tài)。此外，作者進(jìn)一步分析了HLs中可溶性糖的積累和相關(guān)基因的表達(dá)特征，進(jìn)一步證實(shí)L7是葉狀頭部發(fā)育的關(guān)鍵過渡葉。

4、加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

為確定導(dǎo)致過渡葉特殊狀態(tài)的形成過程，作者進(jìn)行加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）。WGCNA共確定了17個(gè)模塊。其中，五個(gè)模塊（greenyellow、magenta、purple、turquoise和yellow）與過渡葉密切關(guān)聯(lián)。兩個(gè)模塊，greenyellow和magenta，與過渡葉特別相關(guān)，并包含許多編碼蛋白激酶的基因，包括絲裂原活化蛋白激酶(MAPK）、鈣依賴性蛋白激酶(CDPK）和富含半胱氨酸的受體樣激酶。關(guān)鍵過渡葉片L7可能受到復(fù)雜信號(hào)相互作用的調(diào)節(jié)，不僅是光和其他外部刺激，也有內(nèi)部激素。

文章亮點(diǎn)

作者報(bào)道了大白菜抽穗期的轉(zhuǎn)錄組圖譜，利用24個(gè)空間解剖組織，分別代表大白菜內(nèi)外葉的不同區(qū)域。全基因組轉(zhuǎn)錄組分析清楚地將內(nèi)葉組織與外葉組織分離開來。通過對(duì)葉片發(fā)育和糖代謝關(guān)鍵基因的空間表達(dá)分析，確定了關(guān)鍵過渡葉，關(guān)鍵過渡葉是第一批內(nèi)彎的葉片。關(guān)鍵過渡葉的形成由一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)控制，不僅包括內(nèi)部激素和蛋白激酶，還包括外部光和其他刺激。這個(gè)發(fā)現(xiàn)為揭示抽穗性狀的遺傳控制提供了新的見解和豐富的資源。研究過程中作者利用生活中常見材料，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，思路簡(jiǎn)單，設(shè)計(jì)巧妙，值得借鑒學(xué)習(xí)。

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2022年值得關(guān)注的7大技術(shù)榜單

2021年利用空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)發(fā)文章呈現(xiàn)井噴式增長(zhǎng)，其中已正式發(fā)表文章有40余篇，而空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)為特色的預(yù)印本bioRxiv搜索“空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（spatial transcriptomics）”一詞，獲得了500余條結(jié)果，其中80余條是在2021年提交的，可以說2021年是空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)應(yīng)用好文發(fā)表突飛猛進(jìn)的一年。

2016年-2021年空間轉(zhuǎn)錄組文章發(fā)表趨勢(shì)和影響因子分布

通過檢索空間轉(zhuǎn)錄組發(fā)表文章的數(shù)據(jù)分析來看，該技術(shù)在2021年中得到廣泛應(yīng)用，并且文章影響因子主要集中在10~20分區(qū)間，其占比高達(dá)39%，其次在30分以上占比達(dá)到30%，由此可見空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用極大提升了文章的質(zhì)量和檔次。

不僅如此，2021年空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)還在物種上有了新的突破，不再局限于人和鼠常見的模式物種，已經(jīng)開始邁入哺乳動(dòng)物（豬）、家禽類（雞）、植物類（擬南芥、云杉、楊樹）等新的物種領(lǐng)域，極大拓展其應(yīng)用范圍。

物種空間轉(zhuǎn)錄組文獻(xiàn)發(fā)表統(tǒng)計(jì)

2021年空間轉(zhuǎn)錄組在不同組織部位上應(yīng)用也取得一些新進(jìn)展：比如骨組織一類就有不少文章發(fā)表，有頭蓋骨[PNAS，IF=11.2]、腰骨骼肌[NatureCommunications，IF=14.9]、肩部肌腱[AnnRheum Dis，IF=19.1 ]；生殖器官有子宮內(nèi)膜[Nat Genet，IF=27.6]、卵巢[NatureBiotechnology，IF=54.9]；泌尿系統(tǒng)：前列腺[Nature Communications，IF=14.9]、膀胱[NatureCommunications，IF=14.9]；腸道組織：胎兒腸道[Cell，IF=41.6]；脂肪組織：皮下腹部[CellMetabolism，IF=27.3]；腦組織：腦內(nèi)炎癥[[Ann Rheum Dis，IF=19.1 ]，IF=24.9]、等皮質(zhì)和海馬[Cell，IF=41.6]、腦神經(jīng)系統(tǒng)[AnnuRev Neurosci，IF=12.4]、前額葉皮層[Nat Neurosci，IF=24.9]、海馬和前額葉皮質(zhì)[NatureCommunications，IF=14.9]等都組織區(qū)域都有不錯(cuò)的研究報(bào)道，甚至連取材最困難的皮膚樣本都發(fā)表重要研究成果：皮膚肉芽腫[Nature Immunology ，IF=25.6]，空間轉(zhuǎn)錄組逐漸在更多的組織類型上得到廣泛的應(yīng)用，揭示更深層次空間維度生物學(xué)表型。

空間轉(zhuǎn)錄組不同組織應(yīng)用發(fā)表文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)

基于上面數(shù)據(jù)我們不難看出來前期研究，腦組織空間基因表達(dá)探索最為廣泛，當(dāng)然還有心臟組織、肝組織前列腺組織；植物主要集中在花序器官的研究，隨著各種組織探索和嘗試，基本上空間轉(zhuǎn)錄組已經(jīng)在各種組織中全面開火，不管從技術(shù)的前瞻性也好，還是從空間這個(gè)維度深度闡釋一些生物學(xué)現(xiàn)象，彌補(bǔ)了細(xì)胞空間位置信息的趨勢(shì)，空間多組學(xué)技術(shù)毫無疑問成為引領(lǐng)科學(xué)研究的風(fēng)向標(biāo)。

后續(xù)文章，敬請(qǐng)關(guān)注：

2021年度空間轉(zhuǎn)錄組動(dòng)植物四大應(yīng)用方向：時(shí)空?qǐng)D譜篇（發(fā)育）、腫瘤篇、疾病機(jī)制篇、生物進(jìn)化篇

關(guān)注我們

大腦是一個(gè)具有精密組織結(jié)構(gòu)的重要器官。對(duì)于大腦結(jié)構(gòu)-功能的關(guān)系、發(fā)育過程中大腦皮層以及退行性神經(jīng)疾病領(lǐng)域的研究，空間轉(zhuǎn)錄組可以揭示更多的信息。單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組結(jié)合可以將關(guān)注的細(xì)胞類型及亞型√確的錨定到空間位置上，解析不同功能區(qū)域與細(xì)胞類型及亞型的關(guān)聯(lián)性。

文獻(xiàn)一

英文題目：Neuroinflammatory astrocyte subtypes in the?mouse brain

中文題目：小鼠大腦神經(jīng)炎性星形細(xì)胞亞型

期刊：nature neuroscience

IF：24.884

文獻(xiàn)鏈接：https://international.biocloud.net/zh/article/detail/34413515

實(shí)驗(yàn)材料：脂多糖（LPS）和生理鹽水（saline）處理的雄性和雌性小鼠進(jìn)行scRNA-seq，共捕獲79944個(gè)星形膠質(zhì)細(xì)胞。3個(gè)LPS和saline小鼠大腦組織切片進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組。

研究背景：星形膠質(zhì)細(xì)胞在感染、急性損傷和慢性神經(jīng)退行性疾病后發(fā)生炎癥轉(zhuǎn)變。這種轉(zhuǎn)變是如何受到時(shí)間和性別的影響，它在單細(xì)胞水平上的異質(zhì)性，以及亞狀態(tài)在大腦中的空間位置上如何分布，目前仍不清楚。

研究結(jié)論：在本研究中作者使用細(xì)菌細(xì)胞壁內(nèi)毒素脂多糖研究小鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞在急性炎癥刺激后的轉(zhuǎn)錄組變化。發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組變化發(fā)生在數(shù)小時(shí)內(nèi)，隨著時(shí)間的推移急劇變化。通過對(duì)約80000個(gè)星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，發(fā)現(xiàn)炎癥引起廣譜的反應(yīng)，亞型星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)歷了不同的炎癥轉(zhuǎn)變，并具有明確的轉(zhuǎn)錄組特征。利用空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和原位雜交技術(shù)將炎癥誘導(dǎo)的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的關(guān)鍵亞狀態(tài)錨定大腦區(qū)域?？傊?，數(shù)據(jù)集為分析星形膠質(zhì)細(xì)胞異質(zhì)性提供了強(qiáng)大的資源，并將有助于理解局部受限反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞亞狀態(tài)的生物學(xué)重要性。

圖1 DLPFC組織空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)

文獻(xiàn)二

英文題目：Neuroinflammatory astrocyte subtypes in the?mouse brain

中文題目：小鼠大腦神經(jīng)炎性星形細(xì)胞亞型

期刊：nature neuroscience

IF：24.884

文獻(xiàn)鏈接：https://international.biocloud.net/zh/article/detail/34413515

實(shí)驗(yàn)材料：脂多糖（LPS）和生理鹽水（saline）處理的雄性和雌性小鼠進(jìn)行scRNA-seq，共捕獲79944個(gè)星形膠質(zhì)細(xì)胞。3個(gè)LPS和saline小鼠大腦組織切片進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組。

研究背景：星形膠質(zhì)細(xì)胞在感染、急性損傷和慢性神經(jīng)退行性疾病后發(fā)生炎癥轉(zhuǎn)變。這種轉(zhuǎn)變是如何受到時(shí)間和性別的影響，它在單細(xì)胞水平上的異質(zhì)性，以及亞狀態(tài)在大腦中的空間位置上如何分布，目前仍不清楚。

研究結(jié)論：在本研究中作者使用細(xì)菌細(xì)胞壁內(nèi)毒素脂多糖研究小鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞在急性炎癥刺激后的轉(zhuǎn)錄組變化。發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組變化發(fā)生在數(shù)小時(shí)內(nèi)，隨著時(shí)間的推移急劇變化。通過對(duì)約80000個(gè)星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，發(fā)現(xiàn)炎癥引起廣譜的反應(yīng)，亞型星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)歷了不同的炎癥轉(zhuǎn)變，并具有明確的轉(zhuǎn)錄組特征。利用轉(zhuǎn)空間錄組學(xué)和原位雜交技術(shù)將炎癥誘導(dǎo)的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的關(guān)鍵亞狀態(tài)錨定大腦區(qū)域?？傊?，數(shù)據(jù)集為分析星形膠質(zhì)細(xì)胞異質(zhì)性提供了強(qiáng)大的資源，并將有助于理解局部受限反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞亞狀態(tài)的生物學(xué)重要性。

圖2 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組鑒定星形細(xì)胞亞群及空間轉(zhuǎn)錄組細(xì)胞定位

文獻(xiàn)三

英文題目：Molecular atlas of the adult mouse brain

中文題目：成年小鼠腦分子圖片

期刊：Science advances

IF：13.116

文獻(xiàn)鏈接：https://international.biocloud.net/zh/article/detail/32637622

實(shí)驗(yàn)材料：三只雄性小鼠（9周齡）的大腦

研究背景：在建立子區(qū)域及其邊界的參考圖以及確定神經(jīng)元類型及其連接性的多樣性方面，對(duì)成年大腦進(jìn)行映射是探索定義動(dòng)物行為多樣性的腦回路的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的核心。實(shí)驗(yàn)神經(jīng)科學(xué)依賴于重復(fù)準(zhǔn)確地記錄和操縱特定大腦區(qū)域中神經(jīng)元亞型活動(dòng)的能力，因此，基因靶向方法已被證明在針對(duì)細(xì)胞類型的靶向中極為有價(jià)值。

研究結(jié)論：作者基于全腦范圍內(nèi)ST模式的無監(jiān)督分類建立了成年小鼠大腦的分子圖譜。這種方法是一個(gè)在全腦范圍內(nèi)映射離散空間域的無偏方法，并且還利用空間信息開發(fā)分子方法以研究神經(jīng)系統(tǒng)組織，引入了分子和空間代碼進(jìn)化保守性的能力，以及它們與生理學(xué)和病理學(xué)的關(guān)系。另外作者簡(jiǎn)化了大腦基因索引測(cè)試區(qū)域分類的能力，這些基因也足以將整個(gè)成年大腦映射到相關(guān)的子區(qū)域。這種方法從分子視角對(duì)全腦進(jìn)行分類繪制圖譜，并比較物種間腦區(qū)域分布的保守分子標(biāo)記，可作為關(guān)鍵點(diǎn)為治療腦部疾病提供新策略。

圖3 空間轉(zhuǎn)錄組繪制全腦分子圖譜

空間轉(zhuǎn)錄組在神經(jīng)學(xué)方向研究思路

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