研究背景
在植物中miRNA是源自有發(fā)夾結(jié)構(gòu)單鏈前體的內(nèi)源性小RNA。miRNA和其靶基因的進(jìn)化代表了一種動(dòng)態(tài)的基因表達(dá)通路，它們?cè)跊Q定植物不同器官發(fā)育中起基礎(chǔ)性的作用。本文利用高通量小RNA測(cè)序的手段研究了山茶花5個(gè)器官的miRNA空間表達(dá)譜。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

材料：Camellia
取樣組織：五個(gè)組織材料（幼嫩葉片、雄蕊、花瓣、心皮和花芽），三個(gè)生物學(xué)重復(fù)
測(cè)序策略：百邁客Illumina HiSeq? 2500 ，SE36
測(cè)序數(shù)據(jù)量：每個(gè)樣本測(cè)了18.9~28.2M的數(shù)據(jù)量

設(shè)計(jì)思路：

研究結(jié)果
1、山茶花5個(gè)組織保守miRNA分析和新miRNA鑒定
miRDeep2軟件鑒定175個(gè)潛在的miRNA。長(zhǎng)度分布分析顯示21和22bp的miRNA豐度*高；對(duì)成熟miRNA的堿基偏好性分析：21和22bp的miRNA首位堿基偏好于“U”；23和24bp的miRNA首位堿基偏好于“A”。

miRNA長(zhǎng)度分布

miRNA堿基偏好性

2、山茶花中MIR160家族的結(jié)構(gòu)和進(jìn)化分析
將成熟的miRNA比對(duì)到植物的ncRNA Database鑒定到19個(gè)miRNA。以MIR160家族為例進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析：基于pre-miRNA序列來構(gòu)建MIR160家族系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示保守的c38436.graph_c0_79977與來自葡萄、楊樹、木薯和蓮花的MIR160形成了一個(gè)分枝，這也與山茶花的進(jìn)化地位相一致。

miRNA 160系統(tǒng)進(jìn)化樹

3、組織間miRNA差異表達(dá)分析

組間差異表達(dá)miRNA維恩圖

4、組織特異性miRNA鑒定
對(duì)不同組織miRNA表達(dá)情況繪制聚類熱圖，大部分miRNA在不同組織中特異表達(dá)。miRNA表達(dá)聚類熱圖顯示一些明顯有著不同表達(dá)模式的亞簇，在此主要關(guān)注了雄蕊和心皮所特異的2個(gè)亞簇。對(duì)雄蕊中特異表達(dá)的miRNA靶基因進(jìn)行GO注釋，顯著富集GO term為“DNA intergration ”和“氧化還原”。

miRNA表達(dá)量聚類熱圖及GO注釋

5、miRNA-靶基因的表達(dá)相關(guān)性驗(yàn)證
選取6個(gè)miRNA及其靶基因進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)4對(duì)表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)的關(guān)系。例如miRNA167靶向2個(gè)SPL基因，用qPCR進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示出強(qiáng)的負(fù)相關(guān)關(guān)系。

miRNA及靶基因表達(dá)量相關(guān)性

6、山茶花中家系特異的miRNAs
(1).為了鑒定山茶花中家系特異miRNA家族，對(duì)不同植物中的miRNA家族構(gòu)建進(jìn)化樹。發(fā)現(xiàn)2個(gè)葡萄特異的miRNA家族出現(xiàn)在山茶花中，其中miR3633是高豐度和高識(shí)別度的，表明它出現(xiàn)在葡萄和山茶花分化之前。

miRNA家族進(jìn)化樹

(2).鑒定到12個(gè)山茶花家系特異miRNA，將其前體序列與NCBI中山茶花和葡萄轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)。在葡萄數(shù)據(jù)集里沒有發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的miRNAs，但是大部分都出現(xiàn)在其他山茶花種里，說明這12個(gè)miRNAs是以家系特異的方式進(jìn)化的。

文章亮點(diǎn)

1：材料選擇；
山茶花是觀賞植物，因其在不同類型重瓣上產(chǎn)生額外的花瓣形成它獨(dú)特的觀賞價(jià)值。了解其花器官發(fā)育的分子機(jī)制有助于新品種的培育。

2：深度數(shù)據(jù)挖掘，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；
從組織特異性和發(fā)育調(diào)控方面，鑒定了組織特異性保守miRNA，深入進(jìn)行靶基因功能注釋富集分析揭示其參與器官形成的機(jī)制；重點(diǎn)關(guān)注控制花器官發(fā)育的miRNA-靶基因調(diào)控機(jī)制，并選擇一些關(guān)鍵miRNA-靶基因進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為miRNA-靶基因環(huán)狀調(diào)控方式提供了依據(jù)。

3：新的分析角度；
從進(jìn)化角度對(duì)山茶花屬的miRNA進(jìn)行了分析，描述了山茶花屬miRNA家系特異型的進(jìn)化方式。