第一代測序技術(shù)應(yīng)用了Sanger雙脫氧鏈終止法，它的讀長可達(dá)1000bp，準(zhǔn)確率高達(dá)99.999%，但測序前需要對特定區(qū)段進(jìn)行引物設(shè)計且通量低，很難應(yīng)用于組學(xué)方面的研究?；诖颂攸c(diǎn)，涌現(xiàn)出二代測序技術(shù)，它主要的特點(diǎn)為短讀長，高通量。以Illumina?Solexa為例，它采用邊測序邊合成的方法，首先利用超聲波將DNA打斷成200-500bp小片段文庫，加接頭后DNA片段隨機(jī)附著于flowcell表面，經(jīng)過橋式PCR擴(kuò)增形成“DNA簇”，實(shí)現(xiàn)堿基信號強(qiáng)度放大，采用邊合成邊測序的方法，進(jìn)行全基因組全面，準(zhǔn)確的測序。

圖1? NovaSeq 6000

百邁客目前主要應(yīng)用2017年Illumina平臺推出的NovaSeq系列測序平臺，雖然較于以往二代平臺，它的測序質(zhì)量值、Index的測序識別、DNA文庫冗余度等指標(biāo)有了明顯提升，但無法克服短讀長的reads 在基因組組裝、大片段變異檢測、轉(zhuǎn)錄組、甲基化等研究中的短板?；诖饲闆r，三代測序應(yīng)運(yùn)而生。

目前，三代測序的主要代表為PicBio和Oxford Nanopore Technologies（ONT）這兩大測序平臺，以O(shè)NT平臺為例，它主要通過電信號識別堿基序列，單鏈DNA/RNA通過納米孔（蛋白通道），不同的堿基會形成特征性離子電流變化信號，通過對這些信號的檢測，得到堿基序列，完成測序。與二代相比，它主要的優(yōu)勢在于在測序前，不會將DNA樣品打斷成小片段，而是對我們提取DNA進(jìn)行片段篩選，一般篩選10-100kb大小的片段進(jìn)行測序，這就對我們前期提取的DNA質(zhì)量要求較高。

三代測序技術(shù)的出現(xiàn)，為復(fù)雜的多倍體基因組組裝帶來了福音。這種基因組由于倍性多，重復(fù)序列高，而二代測序局限于產(chǎn)生單倍體間的共有序列，導(dǎo)致此類物種的研究停滯不前。而ONT平臺由于其長讀長，跨越完整的重復(fù)區(qū)域，大的結(jié)構(gòu)變異也得到了很好的檢測。eg. 納米孔測序技術(shù)可以將T-DNA結(jié)構(gòu)的分辨率提升到36Kb。這就意味著，在這類突變體功能基因定位時，可以直接通過測序的方式，找到材料中T-DNA的插入位置及拷貝數(shù)，從而找到功能基因，實(shí)現(xiàn)基因克隆。和傳統(tǒng)的圖位克隆比較，將大大縮短定位周期。傳統(tǒng)的自然突變材料，如果已經(jīng)有定位區(qū)段，應(yīng)用二代檢測SNP，ONT檢測SV的方式可以讓我們的功能基因克隆方面事半功倍。

在基因組組裝方面，以生菜基因組為例，短讀長的二代測序組裝出21116個contig和2.21G的基因組，基于ONT平臺，則產(chǎn)生了1169個contig，contig N50為7.3Mb。二代數(shù)據(jù)產(chǎn)生了想較于三代數(shù)據(jù)18倍的contig用于基因組組裝，而三代平臺讀長的優(yōu)勢為高質(zhì)量的基因組組裝提供了便利。在轉(zhuǎn)錄組研究方面，ONT平臺的長讀長可以為我們帶來完整的轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體的序列，且可做定量研究，這將避免二代短片段數(shù)據(jù)在轉(zhuǎn)錄本組裝上的錯誤，更好的應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄組研究。

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