英文標(biāo)題：MADS-box transcription factors determine the duration of temporary winter dormancy in closely related evergreen and deciduous Iris spp.

發(fā)表雜志：JournalofExperimentalBotany

影響因子：7.86

發(fā)表單位：浙江大學(xué)

原文鏈接：https://international.biocloud.net/zh/article/detail/34752617

研究背景

冬季休眠是植物應(yīng)對(duì)潛在致命環(huán)境的最關(guān)鍵策略。近幾十年來，由于氣候的變化，在經(jīng)濟(jì)上具有重要意義的多年生雙子葉植物中的這一過程得到了廣泛的研究。然而，在不需要冷卻的常綠單子葉植物中，休眠過程至今仍是一個(gè)謎。因此，揭示這些單子葉植物越冬休眠的調(diào)控機(jī)制，不僅有助于更好地開發(fā)利用植物資源，而且對(duì)應(yīng)對(duì)全球變暖帶來的低溫不足的挑戰(zhàn)具有重要意義。通過多年物候觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，鳶尾和蝴蝶花越冬休眠過程均僅有生態(tài)休眠，將休眠植株移至適宜條件下能迅速恢復(fù)生長(zhǎng)，且在同一栽培地區(qū)二者越冬休眠期存在明顯差異，是研究多年生單子葉植物越冬休眠機(jī)理的理想材料。本研究比較了鳶尾(I.tectorum)和蝴蝶花(I.japonica)在關(guān)鍵發(fā)育時(shí)間點(diǎn)的休眠過程。這兩種鳶尾都表現(xiàn)出短暫的休眠過程，且持續(xù)時(shí)間不同，在溫暖條件下都能很容易地恢復(fù)生長(zhǎng)。為了破譯轉(zhuǎn)錄變化，作者對(duì)鳶尾進(jìn)行了全長(zhǎng)測(cè)序，對(duì)蝴蝶花進(jìn)行了RNA-seq測(cè)序，分別生成參考轉(zhuǎn)錄組，揭示了調(diào)控常綠與落葉類鳶尾越冬休眠的分子機(jī)制。

材料

兩種鳶尾屬植物1年生大小一致的根莖。每?jī)芍懿杉覙悠?包括根梢和3片幼嫩葉片)，立即用液氮冷凍，80℃保存待分析.

方法

鳶尾（IT）：從每個(gè)根尖莖樣品中提取的總RNA等混合構(gòu)建一個(gè)文庫(kù)，利用PacBio平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。并將5個(gè)關(guān)鍵發(fā)育階段，即秋季生長(zhǎng)(FG)、休眠誘導(dǎo)(DI)、休眠(D)、休眠解除(DR)和春季生長(zhǎng)(SG)的樣本使用Illumina進(jìn)行RNA-seq測(cè)序，并設(shè)置三個(gè)生物重復(fù)。

蝴蝶花（IJ）：利用Illumina平臺(tái)對(duì)FG、DI、D、DR、SG階段的樣本進(jìn)行測(cè)序，并進(jìn)行從頭組裝，為蝴蝶花生成參考轉(zhuǎn)錄組。

結(jié)果

一、鳶尾的季節(jié)性生長(zhǎng)-休眠周期和休眠狀態(tài)的確定

作者首先追蹤了鳶尾的季節(jié)性生長(zhǎng)-休眠周期，發(fā)現(xiàn)其在休眠期間的形態(tài)變化不同于多年生雙子葉植物。通過一項(xiàng)大規(guī)模的野外實(shí)驗(yàn)，將常綠鳶尾和落葉鳶尾植物暴露在不同的生長(zhǎng)-休眠狀態(tài)下。兩種鳶尾均表現(xiàn)出相似但不同的生長(zhǎng)-休眠動(dòng)態(tài)。后續(xù)對(duì)采集的樣品進(jìn)行再生長(zhǎng)試驗(yàn)以驗(yàn)證其休眠狀態(tài)，兩種鳶尾均經(jīng)歷了短暫的休眠。值得注意的是，在同一階段，IJ相對(duì)于IT感知到更低水平的休眠誘導(dǎo)刺激。

二、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)差異分析及功能鑒定

IT參考轉(zhuǎn)錄組由短讀RNA-Seq獲得，由83,351個(gè)轉(zhuǎn)錄本組成。IJ的FL參考轉(zhuǎn)錄組由58,654個(gè)平均長(zhǎng)度為2,411bp的非冗余轉(zhuǎn)錄本組成。PCC對(duì)每個(gè)物種的所有轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分析，驗(yàn)證了在每個(gè)階段收集的生物重復(fù)的一致性，不同日期的樣本處于不同的生長(zhǎng)-休眠階段。在IJ和IT分別鑒定出15118個(gè)和10176個(gè)差異轉(zhuǎn)錄本。為了確定不同生長(zhǎng)-休眠階段之間的轉(zhuǎn)錄變化，作者比較了每個(gè)鳶尾物種在相鄰階段的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)，在IJ中生長(zhǎng)-休眠轉(zhuǎn)變比休眠-生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變引起更復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄變化，而在IT中正好相反。這些表達(dá)差異與物種間的形態(tài)差異一致。轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)顯示LOB、MADSMIKC和NF-YC轉(zhuǎn)錄因子家族在IJ中差異比率最高。為了更深入地了解物種間差異轉(zhuǎn)錄本的功能差異，我們對(duì)每個(gè)比較中上調(diào)或下調(diào)的差異轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行KEGG富集分析。各鳶尾物種在D期前后，代謝途徑相對(duì)豐富，尤其是碳水化合物相關(guān)的代謝途徑，并且對(duì)差異表達(dá)變化明顯的基因進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

三、共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)揭示了越冬性休眠特有的基因模塊

為了了解基因和通路的動(dòng)態(tài)變化，并識(shí)別鳶尾越冬性休眠過程中的休眠相關(guān)模塊，我們對(duì)IJ的所有15118個(gè)差異轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了WGCNA分析，共鑒定出12個(gè)共表達(dá)模塊.對(duì)每個(gè)模塊進(jìn)行了主要的表達(dá)趨勢(shì)和KEGG富集分析。并進(jìn)行模塊-形狀關(guān)聯(lián)分析，選擇形狀特異性模塊和階段特異性模塊。結(jié)果中找到分別與冬季生長(zhǎng)率呈顯著正、負(fù)相關(guān)的生長(zhǎng)模塊（red）和休眠模塊（brown），MADS-box家族基因FUL/AP1和SVP分別位于兩個(gè)模塊，并與植物激素合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、碳水化合物代謝和環(huán)境響應(yīng)通路基因共表達(dá)。

四、差異轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)及與植物激素相關(guān)的生理特性

為了進(jìn)一步解剖鳶尾越冬休眠所必需的基因和通路，我們對(duì)基因表達(dá)譜和相關(guān)生理特征進(jìn)行了更詳細(xì)的研究。結(jié)果表明，脫落酸水平在D期升高了兩倍以上，并與SER呈顯著負(fù)相關(guān)，表明脫落酸在鳶尾越冬休眠中的保守作用。脫落酸生物合成和分解代謝的穩(wěn)態(tài)jing q調(diào)控植物中的脫落酸水平。相比之下，IJ中參與脫落酸生物合成的差異轉(zhuǎn)錄本在DI過程中保持較低的表達(dá)水平。因此，作者推斷IJ中脫落酸水平的降低比IT中保證了更長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)周期。推測(cè)這可能是由于脫落酸生物合成的抑制和分解代謝的活躍所致。

與脫落酸不同的是，在之前的休眠研究中很少關(guān)注茉莉酸。然而，茉莉酸與脫落酸協(xié)同相互作用，阻止植物生長(zhǎng)，并調(diào)節(jié)防御過程。相比之下，兩種虹膜物種的茉莉酸水平與SER呈正相關(guān)，并與生長(zhǎng)相關(guān)的MERed呈顯著正相關(guān)，表明茉莉酸可能促進(jìn)鳶尾越冬性休眠期間的生長(zhǎng)。因此，茉莉酸生物合成基因LOX的強(qiáng)烈上調(diào)可能有助于兩種鳶尾在DR階段茉莉酸的快速積累。此外，在兩個(gè)物種中茉莉酸/脫落酸和SER均呈正相關(guān)，表明茉莉酸和脫落酸可能在鳶尾越冬性休眠過程中起拮抗作用。在本研究中，編碼茉莉酸的差異轉(zhuǎn)錄本在兩種鳶尾中均表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式，這可能導(dǎo)致了不同的休眠時(shí)間。它們不同的串?dāng)_模式可能與虹膜越冬性休眠的形成有關(guān)，因?yàn)槊撀渌岷蛙岳蛩峥梢詤f(xié)調(diào)作用常綠和落葉鳶尾的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和應(yīng)激反饋。

五、差異轉(zhuǎn)錄本在碳水化合物代謝和蔗糖和淀粉含量中的表達(dá)

蔗糖是從光合源器官(如葉片)到貯藏組織的初級(jí)糖。當(dāng)植物處于旺盛狀態(tài)時(shí)，蔗糖轉(zhuǎn)化為淀粉的轉(zhuǎn)化率很高。相反，淀粉降解途徑主要通過積累可溶性糖來降低細(xì)胞滲透壓，同時(shí)釋放內(nèi)休眠和構(gòu)建生態(tài)休眠。因此，處于生態(tài)休眠狀態(tài)的植物在休眠器官中積累了較高的糖含量，并且在休眠植物中糖含量更高。與此相一致，IJ中蔗糖含量較低可能導(dǎo)致休眠持續(xù)時(shí)間相對(duì)于IT較短。此外，正如之前所觀察到的，IJ中較低的淀粉積累在一定程度上證實(shí)了其較低的生態(tài)休眠特征。此外，蔗糖含量可能作為信號(hào)分子影響脫落酸敏感性，從而抑制生長(zhǎng)。與此相一致的是，脫落酸相關(guān)基因與IJ淀粉合成模塊中的基因共表達(dá)。綜上所述，IJ中活性淀粉的生物合成和活性淀粉的降解程度較高，導(dǎo)致蔗糖含量較低的時(shí)間較長(zhǎng)，這可能與休眠時(shí)間比IT短有關(guān)。

六、差異轉(zhuǎn)錄本與ROS清除中的生理生化變化

ROS積累被認(rèn)為是觸發(fā)生態(tài)氣味的重要信號(hào)機(jī)制，并與休眠時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。與此同時(shí)，激活抗氧化防御和解毒途徑以去除ROS。在本研究中，差異轉(zhuǎn)錄本從DI到DR，與IJ相比，IT脯氨酸積累更多，SOD活性更高，表明IT中ROS清除能力更強(qiáng)。同樣，編碼GST的差異轉(zhuǎn)錄本上調(diào)的時(shí)間更早，這可能導(dǎo)致休眠進(jìn)入IT的時(shí)間較早。綜上所述，這些指標(biāo)的變化使IT比IJ表現(xiàn)出更強(qiáng)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。因此，相對(duì)于IT，IJ中脯氨酸濃度較低，SOD活性較低，GST基因表達(dá)隨后升高，表明IJ中休眠時(shí)感知的ROS應(yīng)激水平較低，這可能導(dǎo)致其休眠時(shí)間較短。

七、休眠過程中MIKCCMADS-box基因的系統(tǒng)發(fā)育分析及表達(dá)模式

MIKCCMADS-box基因編碼在植物生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子在真核生物中高度保守。為了研究鳶尾MIKCCMADS-box蛋白之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，并對(duì)其亞家族進(jìn)行分類，以具有代表性的植物為樣本構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，揭示了其在單、雙子葉植物中的保守性，以及FLC和FUL/AP1等在多年生單子葉植物短暫越冬休眠過程中的新功能。

總結(jié)

本研究通過全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組分析，得到MADS-box家族基因可能在調(diào)控鳶尾越冬休眠過程中發(fā)揮重要功能，并通過WGCNA共表達(dá)分析找到與冬季生長(zhǎng)率相關(guān)的基因模塊，并對(duì)上述通路的基因表達(dá)和生理生化變化進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)脫落酸和茉莉酸在協(xié)調(diào)兩種鳶尾越冬生長(zhǎng)和脅迫響應(yīng)中發(fā)揮拮抗作用，而碳水化合物代謝和活性氧清除能力的差異可能導(dǎo)致了常綠與落葉鳶尾越冬休眠期長(zhǎng)短不同。另外，對(duì)兩種鳶尾和代表性植物MIKCCMADS-box成員進(jìn)行進(jìn)化分析，揭示了單子葉在臨時(shí)WD過程中的一些共同特征，以及單子葉中可能存在的新角色，如開花位點(diǎn)C和FUL。綜合來看，本項(xiàng)研究結(jié)果不僅提供了多年生單子葉植物中越冬休眠的圖像，而且也為植物中越冬休眠的調(diào)控機(jī)制提供了新的見解。

研究背景

甘薯是許多發(fā)展中國(guó)家重要的作物之一，也是重要的能量來源。甘薯是同源六倍體植物，基因組大小約3-4G，目前還沒有高質(zhì)量的參考基因組。甘薯采用異花授粉的繁殖方式，自交不孕，導(dǎo)致基因組的雜合度高，目前還沒有關(guān)于甘薯正向遺傳學(xué)研究的報(bào)道。幾乎所有關(guān)于甘薯轉(zhuǎn)錄本的研究都是采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法，沒有獲得大規(guī)模的全長(zhǎng)cDNA序列，因此阻礙了甘薯功能基因組學(xué)和分子育種研究的進(jìn)展。長(zhǎng)期以來，人們一直認(rèn)為甘薯有可能由二倍體祖先野生甘薯（I. trifida）進(jìn)化而來，但是沒有確鑿的證據(jù)。

研究目的

通過2+3聯(lián)合測(cè)序的方法獲得甘薯和野生甘薯的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，揭示二者的進(jìn)化關(guān)系。

材料方法

實(shí)驗(yàn)材料
甘薯和野生甘薯，不同組織（幼葉、成熟葉、莖尖、莖稈、須根、起始?jí)K根、膨大塊根和成熟塊根）分別等重量混合，提取RNA用于三代測(cè)序；同樣的材料用于二代測(cè)序。
測(cè)序方法及數(shù)據(jù)量
百邁客Pacbio RSII：構(gòu)建1-2k、2-3k、>3k的3個(gè)文庫(kù)，每個(gè)文庫(kù)分別測(cè)1個(gè)、2個(gè)、1個(gè)cell，共8個(gè)cell。
百邁客Illumina HiSeq 2500：甘薯和野生甘薯各測(cè)了17G和11G數(shù)據(jù)。

技術(shù)路線

研究結(jié)果

5.1 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的統(tǒng)計(jì)及結(jié)構(gòu)注釋分析
統(tǒng)計(jì)三代的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)：甘薯得到220,035 個(gè)ROI（reads of insert），其中全長(zhǎng)非嵌合轉(zhuǎn)錄本（Full-Length Non-Chimeric, FLNC）占49.9％，非全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本（Non-Full-Length, NFL）占46.6％；野生甘薯得到195,188 個(gè)ROI，其中FLNC 和NFL 分別占52.1％和43.9％。對(duì)三代的數(shù)據(jù)進(jìn)行矯正（自我糾錯(cuò)+二代數(shù)據(jù)矯正），甘薯和野生甘薯分別獲得了53,861和51,184個(gè)非冗余轉(zhuǎn)錄本。此外，甘薯和野生甘薯分別預(yù)測(cè)到了104,540 和94,174 個(gè)ORF，全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本（同時(shí)含有5’-UTR，CDS和3’-UTR）分別有34,963和33,637個(gè)。甘薯和野生甘薯分別鑒定到了 25,315和 27,090 個(gè)SSR，以及471 和531 個(gè)lncRNA。

Figure 1. 對(duì)三代測(cè)序的數(shù)據(jù)進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)和結(jié)構(gòu)注釋

5.2 甘薯、野生甘薯與其它植物的CDS比較分析
為了評(píng)估甘薯、野生甘薯的轉(zhuǎn)錄本和其他植物基因的相似性，我們比較了甘薯、野生甘薯與其他植物的開源CDS數(shù)據(jù)庫(kù)，包括紅苔藤、野生甘薯、牽?；ā煵?、馬鈴薯、大豆、擬南芥和水稻。結(jié)果表明甘薯和野生甘薯大多數(shù)的轉(zhuǎn)錄本都是同源的，說明這兩個(gè)物種擁有一個(gè)大致相同的基因庫(kù)。觀察高比例的轉(zhuǎn)錄本發(fā)現(xiàn)，盡管這些物種中的大量基因在進(jìn)化過程中存在著巨大的差異，但仍然共有一些短的motif，說明這些基因在進(jìn)化上顯示出高度的保守性。

Figure 2. 比較甘薯、野生甘薯和其他植物的轉(zhuǎn)錄本

5.3 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)分析
三代測(cè)序得到的全長(zhǎng)cDNA對(duì)于研究基因的結(jié)構(gòu)非常有用，例如分析外顯子-內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)。我們隨機(jī)挑選了50個(gè)基因進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)這些基因含有的外顯子數(shù)目在甘薯、野生甘薯和擬南芥三個(gè)植物中的分布是相似的。

Figure 3. 分析甘薯、野生甘薯和擬南芥的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)

5.4 甘薯和野生型甘薯的Ka/Ks分析
人們普遍認(rèn)為二倍體野生甘薯是六倍體作物甘薯的祖先，為了尋找參與甘薯進(jìn)化的候選基因，我們研究了甘薯和野生甘薯的基因選擇模式。首先比較了二者的完整轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)集，去除有多種同源性可能的那些轉(zhuǎn)錄本，確定了1269個(gè)假定的甘薯和野生甘薯之間的同源基因?qū)?。隨后，計(jì)算了每個(gè)基因?qū)Φ腒a/Ks比值，大多數(shù)基因?qū)Φ腒a/Ks比值都小于1，只有56個(gè)基因?qū)Φ腒a/Ks比值大于1，表明在甘薯的進(jìn)化或馴化過程中，大多數(shù)基因都是受到純化選擇的。而受到正向選擇的這些基因?qū)⒆鳛楹罄m(xù)研究的重點(diǎn)。

Figure 4. 分析甘薯和野生甘薯同源基因?qū)Φ腒a/Ks比值

創(chuàng)新點(diǎn)

1，對(duì)于無參或者參考基因組不好的物種，全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組可以獲得轉(zhuǎn)錄本全長(zhǎng)序列，完善基因組注釋的信息。
2，通過全長(zhǎng)比較轉(zhuǎn)錄組分析研究近源物種間的進(jìn)化關(guān)系。

參考文獻(xiàn)：
Generation and comparative analysis of full-length transcriptomes in sweetpotato and its putative wild ancestor I. trifida（bioRxiv在線發(fā)表，2017）