2025年3月，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院器官移植研究所蘭培祥教授、陳知水教授和肝臟外科程琪教授研究團(tuán)隊(duì)在Journal of Hepatology發(fā)表題為”Sour Neuronal Signalling Attenuates Macrophage Mediated Liver Injury”的研究論文。研究使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)等多種技術(shù)，深入闡述人鼠中減輕肝缺血再灌注損傷的腦-肝軸調(diào)控通路，發(fā)現(xiàn)酸味刺激竟然可以通過神經(jīng)信號(hào)緩解肝臟損傷！這一發(fā)現(xiàn)不僅為肝臟疾病的治療提供了新思路，還從現(xiàn)代科學(xué)的角度驗(yàn)證了中醫(yī)“酸入肝”的理論。

文章標(biāo)題：Sour Neuronal Signalling Attenuates Macrophage Mediated Liver Injury

期刊名稱：Journal of Hepatology

影響因子：26.7

合作單位：華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院

百邁客生物為該研究提供了10X單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)服務(wù)。

研究背景

在中醫(yī)理論中，酸味與肝臟有著密切的關(guān)系。中醫(yī)經(jīng)典《黃帝內(nèi)經(jīng)》中提到“酸入肝”，認(rèn)為酸味食物能夠滋養(yǎng)肝臟，調(diào)和氣血，促進(jìn)肝臟的生理功能。像檸檬、山楂、醋等酸味食物，常被用來調(diào)理肝氣郁結(jié)、疏肝解郁。這次的研究，不僅讓中醫(yī)的古老智慧得到了科學(xué)驗(yàn)證，還為酸味在肝臟疾病治療中的應(yīng)用提供了新的依據(jù)。

肝損傷是多種肝病常見的病理生理基礎(chǔ)，與炎癥有關(guān)。肝缺血再灌注損傷是一種局部無菌炎癥響應(yīng)，主要由先天免疫細(xì)胞驅(qū)動(dòng)，是肝切除術(shù)中早期器官功能障礙和衰竭的重要原因。傳統(tǒng)認(rèn)為肝缺血再灌注引起的炎癥是由肝和死亡細(xì)胞釋放的DAMP（損傷相關(guān)分子蛋白）被肝駐留庫(kù)普夫細(xì)胞、單核細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞等識(shí)別，釋放趨化因子和促炎癥因子，招募循環(huán)白細(xì)胞促使炎癥發(fā)生。此外，近年來，神經(jīng)免疫調(diào)控成為研究熱點(diǎn)，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)系統(tǒng)可以通過釋放神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)肽等分子來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。然而，如何通過神經(jīng)信號(hào)來治療肝臟炎癥，仍然是一個(gè)未解之謎。

材料及方法

研究方法：單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（n=3，肝及腹腔神經(jīng)節(jié)），組織學(xué)染色，熒光染色，病毒示蹤，免疫印記，免疫沉淀串聯(lián)質(zhì)譜，bulk RNA-seq，qRT-PCR，流式細(xì)胞術(shù)等。

研究材料：C57BL/6J小鼠缺血再灌注損傷模型，Fam19a2-/-Ccr2-/-小鼠，小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT122。

研究結(jié)果

1.酸刺激減輕肝缺血再灌注損傷

研究者首先構(gòu)建酸刺激下肝臟缺血再灌注損傷（IRI）小鼠模型，發(fā)現(xiàn)酸刺激可以減少肝組織損傷以及血清標(biāo)志物水平。但是，使用丁卡因局麻小鼠舌頭或者灌胃檸檬酸不能減少肝損傷和血清標(biāo)志物水平；NMDAR阻斷劑1（阻斷NMDAR介導(dǎo)的興奮性突觸傳遞）立體定位注射到腹后內(nèi)側(cè)核（VPN）后，酸刺激后IRI肝的血清標(biāo)志物水平和肝損傷程度無明顯變化，表明神經(jīng)系統(tǒng)在酸刺激減輕IRI過程中起重要作用。此外，小鼠VPN注射示蹤病毒的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肝臟以及CG（腹腔神經(jīng)節(jié)）均檢測(cè)到熒光，行腹腔神經(jīng)節(jié)切除術(shù)能降低IRI肝的組織損傷和血清標(biāo)志物水平，表明酸刺激減輕肝損傷過程通過腦-CG-肝軸。

圖1-酸通過神經(jīng)減輕小鼠肝臟缺血再灌注損傷

圖2-腦和肝中分布的H129感染神經(jīng)

2.酸刺激通過減少TAFA2產(chǎn)生降低肝IRI

對(duì)肝IRI小鼠、酸刺激后肝IRI小鼠及sham（假手術(shù)）小鼠的肝臟和CG進(jìn)行單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)果顯示IRI引起肝細(xì)胞和神經(jīng)元基因表達(dá)譜發(fā)生變化，IRI肝中免疫細(xì)胞數(shù)量增加，但酸刺激后IRI樣本中免疫細(xì)胞數(shù)量減少。神經(jīng)元較為特異性地表達(dá)TAFA2，IRI可引起肝神經(jīng)元TAFA2表達(dá)水平增加，但酸刺激使得TAFA2表達(dá)水平降到與sham對(duì)照組相近水平。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鉀離子可引起小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22顯著高表達(dá)TAFA2，使用鉀離子通道抑制劑可減輕肝損傷，支持酸刺激通過神經(jīng)系統(tǒng)減輕肝損傷的假設(shè)。進(jìn)一步的，使用慢病毒敲低神經(jīng)元TAFA2表達(dá)水平或使用TAFA2敲基因鼠，發(fā)現(xiàn)IRI引起的肝組織損傷、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)以及血清標(biāo)志物水平降低，表明TAFA2在肝IRI中有著重要作用。

圖3-酸刺激減少小鼠IRI肝中神經(jīng)細(xì)胞Fam19a2表達(dá)水平

圖4-Fam19a2敲除或敲低，使得小鼠肝臟缺血再灌注損傷降低

?3.IRI肝中TAFA2與巨噬細(xì)胞相互作用

體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TAFA2不引起肝細(xì)胞凋亡；snRNA-seq數(shù)據(jù)顯示IRI肝中巨噬細(xì)胞比例增加且炎癥相關(guān)基因表達(dá)水平增加，但在酸刺激組中降低；流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TAFA2與巨噬細(xì)胞結(jié)合而不與T/B細(xì)胞結(jié)合，不論是否酸刺激T/B細(xì)胞比例無顯著變化，IRI肝中CD11b+F4/80low?巨噬細(xì)胞增加而酸刺激可降低該巨噬細(xì)胞數(shù)量；TAFA2敲除或敲低抑制IRI肝中巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，這些結(jié)果表明TAFA2促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TAFA2可以激活BMDM（骨髓來源巨噬細(xì)胞），引起Il1α，Il1β，Il6和Tnfα的表達(dá)，這些結(jié)果表明TAFA2激活的巨噬細(xì)胞介導(dǎo)了肝IRI。

圖5-TAFA2使得IRI中巨噬細(xì)胞比例增加，刺激炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生

4.TAFA2通過CCR2與巨噬細(xì)胞互作

體外實(shí)驗(yàn)表明巨噬細(xì)胞上的CCR2是TAFA2受體，CCR2敲除小鼠IRI肝的組織損傷以及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)降低，血清標(biāo)志物水平降低。TAFA2或CCL2刺激后BMDM的bulk RNA-seq數(shù)據(jù)表現(xiàn)出幾乎一致的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜，粘附、代謝、Ras信號(hào)通路相關(guān)差異基因表達(dá)上調(diào)，代謝和核糖體通路相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，TAFA2誘導(dǎo)BMDM更高的表達(dá)Il1α，Il1β，Il6，Tnfα以及干擾素相關(guān)基因，促進(jìn)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥響應(yīng)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明TAFA2促使巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥響應(yīng)主要依賴CCR2，但巨噬細(xì)胞上也可能存在其他的TAFA2受體。

圖6-TAFA2與巨噬細(xì)胞表面CCR2互作

5.酸刺激減輕人類肝切除術(shù)中肝IRI

為了確認(rèn)酸刺激在人類肝IRI中的作用，研究者進(jìn)行了開放、隨機(jī)、空白對(duì)照臨床試驗(yàn)（ChiCTR2400088096），包含多種良性/惡性肝腫瘤、肝外傷、膿腫、囊腫和包蟲病，由于手術(shù)期間門靜脈短暫阻斷以減少肝切除過程中出血，導(dǎo)致肝出現(xiàn)缺血再灌注損傷。干預(yù)組33名患者，術(shù)前24h開始，每8h給與新鮮的25mM檸檬酸（持續(xù)5min），對(duì)照組33名患者不接受酸刺激，剔除6名術(shù)中肝缺血超過30min患者以及4名依從性差患者，肝切除術(shù)后第1/3/5天對(duì)患者肝功能進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果顯示酸刺激組血清ALT和AST水平顯著低于對(duì)照組，高ALT水平（>500 U/L）患者數(shù)量也顯著更低，這些結(jié)果表明酸刺激可減輕人類肝切除術(shù)引起的肝IRI。

圖7-酸刺激減輕人類肝切除術(shù)中肝IRI

研究總結(jié)

該研究首次揭示了腦-肝軸在肝臟IRI中的調(diào)控作用，闡明了酸味刺激通過神經(jīng)信號(hào)通路緩解肝臟損傷的機(jī)制。研究不僅為肝臟IRI的治療提供了新的思路，還為神經(jīng)免疫調(diào)控在其他器官炎癥中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。研究團(tuán)隊(duì)表示，未來將進(jìn)一步探索神經(jīng)刺激療法在肝臟疾病中的應(yīng)用，特別是通過調(diào)控腦-肝軸來緩解肝臟炎癥和損傷。此外，研究團(tuán)隊(duì)還將深入研究TAFA2蛋白的作用機(jī)制，開發(fā)針對(duì)TAFA2-CCR2信號(hào)通路的靶向藥物，為肝臟疾病的治療提供更多選擇。

豬不僅是重要的經(jīng)濟(jì)家畜，還在科研中扮演重要角色。豬器官與人類器官高度相似，被廣泛用于臨床前研究。

2020年，馬斯克展示了植入腦機(jī)芯片的豬，展示了腦電波信號(hào)的變化；2021年以來，全球已完成豬器官移植到腦死亡患者的實(shí)驗(yàn)；2025年，空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院又一次成功實(shí)施了豬肝臟異種移植到人腦死亡患者體內(nèi)，與之前不一樣的是，這次是切除人類肝臟后只保留豬肝臟，探討豬肝能否完全替代人肝。

從時(shí)空實(shí)驗(yàn)應(yīng)用條件看，豬的器官組織特征與人類接近，實(shí)驗(yàn)開發(fā)難度較低。豬是二倍體生物，基因組質(zhì)量良好，有基因表達(dá)調(diào)控?cái)?shù)據(jù)庫(kù)和單細(xì)胞數(shù)據(jù)，便于跨物種比較研究。綜上，時(shí)空技術(shù)的應(yīng)用可提升研究精度，為后續(xù)研究提供精準(zhǔn)參考。

1.豬早期卵子發(fā)生的時(shí)空?qǐng)D譜

英文標(biāo)題：Spatiotemporal dynamics of early oogenesis in pigs

發(fā)表期刊：Genome Biology

影響因子：10.1

發(fā)布時(shí)間：2025-01

DOI：10.1186/s13059-024-03464-8

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)空部分：

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，豬E45、E55、E65、E75胚胎卵巢（n=2）。

空間轉(zhuǎn)錄組，豬E45、E55、E65、E75胚胎卵巢，10x Visium；E65胚胎卵巢，BMKMANU S1000。

百邁客生物為該研究提供了百創(chuàng)S1000空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)服務(wù)。

研究?jī)?nèi)容總結(jié)：

① 該研究結(jié)合單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)(ST)探索在豬卵子發(fā)生早期卵巢微環(huán)境的空間組織，構(gòu)建時(shí)空基因表達(dá)譜。將卵子發(fā)生不同階段的生殖細(xì)胞簇投射到空間圖譜中，揭示了發(fā)育中的豬卵巢中生殖細(xì)胞的“皮質(zhì)-髓質(zhì)(C-M)”分布。豬和人之間的跨物種分析揭示了在卵子發(fā)生過程中生殖細(xì)胞的保守的C-M分布模式，提示豬可以作為人類早期卵子發(fā)生過程的理想研究模型。

② 利用ST數(shù)據(jù)進(jìn)行RNA速度分析，確定了豬卵巢皮質(zhì)和髓質(zhì)區(qū)顆粒細(xì)胞系的分子特征和空間動(dòng)力學(xué)。通過空間共定位分析和細(xì)胞間通訊分析，揭示了皮質(zhì)和髓質(zhì)區(qū)域生殖細(xì)胞和體細(xì)胞之間獨(dú)特的細(xì)胞-細(xì)胞通訊模式。

③ 值得注意的是，卵巢組織的體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)細(xì)胞間NOTCH信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白在啟動(dòng)減數(shù)分裂和卵子形成程序中起關(guān)鍵作用，表明卵巢微環(huán)境對(duì)于生殖細(xì)胞的命運(yùn)調(diào)控起著重要作用。

圖1-基于Cell2location，使用scRNA-seq數(shù)據(jù)對(duì)ST數(shù)據(jù)進(jìn)行解卷積

2.時(shí)空技術(shù)解析豬滋養(yǎng)層類器官與母胎界面細(xì)胞多樣性

英文標(biāo)題：Defining Cellular Diversity at the Swine Maternal-Fetal Interface Using Spatial Transcriptomics and Organoids

發(fā)表期刊：bioRxiv

發(fā)布時(shí)間：2024-10

DOI：10.1101/2024.10.21.619461

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)空部分：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，滋養(yǎng)層細(xì)胞系類器官（n=3)。空間轉(zhuǎn)錄組：G65臍帶殘端附近1cm*1cm完整胎盤（包括母體和子代組織，n=4）。

研究?jī)?nèi)容總結(jié)：

① 研究者使用足月豬胎盤構(gòu)建的sTO（豬滋養(yǎng)層類器官）可以擴(kuò)增、凍存并成功復(fù)蘇，高表達(dá)滋養(yǎng)層標(biāo)志基因KRT18、ELF3以及GATA3，與豬胎盤表達(dá)標(biāo)志更相似。此外，在人工基底膜中培養(yǎng)立刻形成懸浮培養(yǎng)可逆的局部頂面，通過和體內(nèi)較為一致的基因表達(dá)和細(xì)胞通訊程序分化成不同滋養(yǎng)層細(xì)胞。與當(dāng)前其他可用的體外模型相比，研究者開發(fā)的sTO是更理想的體外研究模型。

② 使用空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)定義妊娠中期豬母胎界面上滋養(yǎng)層原位轉(zhuǎn)錄組圖譜，無需依賴傳統(tǒng)標(biāo)志，揭示了豬子宮和胎盤的新marker，可用于精準(zhǔn)定義豬母胎界面組織學(xué)結(jié)構(gòu)；數(shù)據(jù)還包含以往未分析到的腺窩區(qū)（areola）和交界區(qū)，定義出3種腺窩細(xì)胞亞群，例如主要位于胎盤間質(zhì)附近而不明顯與交界區(qū)直接接觸的Areola-1?？傊?，該圖譜為后續(xù)豬生殖研究提供了基礎(chǔ)參考。

③ 空間數(shù)據(jù)可用于注釋sTO單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的細(xì)胞類型，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)sTO涵蓋了豬胎盤中滋養(yǎng)層細(xì)胞群的發(fā)育和功能差異，sTO和胎盤組織具有相同保守的關(guān)鍵信號(hào)通路。此外，由于sTO中有更多增殖干細(xì)胞，因而僅在sTO單細(xì)胞數(shù)據(jù)中觀察到增殖干細(xì)胞與其他滋養(yǎng)層間存在互作?？傊?，這些凸顯了sTO在研究豬胎盤發(fā)育中的用途。

圖2-空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)解析豬母胎界面的全局表達(dá)情況

3.豬竇卵泡的單細(xì)胞圖譜

英文標(biāo)題：Deciphering Cellular Heterogeneity and Communication Patterns in Porcine Antral Follicles by Single-Cell RNA Sequencing

發(fā)表期刊：Animals

發(fā)布時(shí)間：2023-09

DOI：10.3390/ani13193019

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)空部分：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組：D210母豬（取樣前48h內(nèi)注射5 IU PMSG）竇卵泡（n=2）。

研究?jī)?nèi)容總結(jié)：

① 單細(xì)胞數(shù)據(jù)揭示了豬竇卵泡內(nèi)細(xì)胞的顯著異質(zhì)性，特別是顆粒細(xì)胞，研究者首次在豬中確認(rèn)壁顆粒細(xì)胞（mGC）和卵丘細(xì)胞（nGC）存在不同亞群，例如mGC1亞群在激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起到重要作用，而mGC2主要負(fù)責(zé)雌激素合成，cGC2負(fù)責(zé)糖酵解和卵丘擴(kuò)張，cGC1亞群具有mGC和cGC兩種顆粒細(xì)胞特征，表明卵泡內(nèi)存在多種狀態(tài)和功能的細(xì)胞。

② 兩個(gè)樣本的細(xì)胞組成和通訊模式具有顯著差異。AF75可能是成熟卵泡狀態(tài)，明顯定義出不同功能cGC亞群，負(fù)責(zé)卵丘擴(kuò)張的cGC2數(shù)量多。AF76可能是較不成熟的卵泡狀態(tài)，cGC2數(shù)量較少，具有cGC3和cGC5亞群。③ 揭示豬竇卵泡內(nèi)復(fù)雜的通訊網(wǎng)絡(luò)，多數(shù)是通過間隙連接和分泌因子介導(dǎo)的細(xì)胞間互作，顆粒細(xì)胞群中cGC表現(xiàn)出更強(qiáng)的活性。

圖3-豬竇狀卵泡中細(xì)胞的降維聚類結(jié)果

4.豬皮膚早期發(fā)育的時(shí)空?qǐng)D譜

英文標(biāo)題：Integrating Single-Cell and Spatial Transcriptomics Reveals Heterogeneity of Early Pig Skin Development and aSubpopulation with Hair Placode Formation

發(fā)表期刊：Advanced Science

影響因子：14.3

發(fā)布時(shí)間：2024-04

DOI：10.1002/advs.202306703

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)空部分：

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，E37胚胎（n=1，未知U），E41&E52&E85胚胎（每時(shí)期n=2，同窩有毛N、無毛H各1）。

空間轉(zhuǎn)錄組，E37胚胎（n=1），E41&E52&E85胚胎（每時(shí)期n=2，同窩有毛N、無毛H各1）。

研究?jī)?nèi)容總結(jié)：

① 單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析得到7種主要細(xì)胞類型，空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析得到6種主要細(xì)胞類型，包括免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、施旺細(xì)胞等，且不同類型細(xì)胞空間分布與已知的皮膚組織解剖結(jié)構(gòu)相一致，相關(guān)性分析表明單細(xì)胞數(shù)據(jù)和空間數(shù)據(jù)中鑒定出的細(xì)胞類型一致性較高。

② 聯(lián)合已發(fā)表的人、小鼠皮膚單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)豬表皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞以及周細(xì)胞表達(dá)更多保守的特異性標(biāo)志基因，這些基因也與人類皮膚疾病相關(guān)，表明與小鼠相比，豬皮膚或許是一種更合適的人皮膚疾病研究模型。

③ 表皮細(xì)胞簇進(jìn)一步聚類得到9種亞型，OGN+/UCHL1+ 細(xì)胞主要在E37U中存在，毛囊間表皮（IFE）基底層細(xì)胞與祖細(xì)胞從E41到E52表現(xiàn)出增加趨勢(shì)。擬時(shí)序分析結(jié)果顯示存在兩種分化軌跡，OGN+/UCHL1+ 細(xì)胞—>IFE基底層細(xì)胞和真皮細(xì)胞前體（pre-DC）、OGN+/UCHL1+ 細(xì)胞—>成熟毛囊基底（Pc）發(fā)育和毛囊（HF）及角質(zhì)細(xì)胞分化。真皮成纖維細(xì)胞簇進(jìn)一步聚類得到乳頭狀成纖維細(xì)胞和網(wǎng)狀成纖維細(xì)胞，進(jìn)一步分析在E37U中鑒定出成纖維祖細(xì)胞。

④ 有毛豬中Pc的形成時(shí)期為E37-E41，無毛豬中缺乏Pc細(xì)胞。CytoTRACE、逆時(shí)序分析等結(jié)果表明，無毛豬OGN+/UCHL1+ 細(xì)胞增殖和遷移異常導(dǎo)致Pc不能正常形成，BMP和TGFβ是引起OGN+/UCHL1+ 細(xì)胞形成Pc的首個(gè)信號(hào)通路。

圖4-ST和scRNA-seq鑒定的常見細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄組之間具有高度一致性

5.豬出生后肝臟發(fā)育的單細(xì)胞動(dòng)態(tài)圖譜

英文標(biāo)題：Single-cell dynamics of liver development in postnatal pigs

發(fā)表期刊：Science Bulletin

影響因子：18.8

發(fā)布時(shí)間：2023-09

DOI：10.1016/j.scib.2023.09.021

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)空部分：

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，出生后不同胎齡豬肝臟，D30(n = 3)，D42 (n = 3)，D150(n = 1)，D730(n = 2)。

單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組，出生后不同胎齡豬肝臟，D30(n = 1)，D42 (n = 1)，D150(n = 1)，D730(n = 1)；驗(yàn)證隊(duì)列，不同胚胎時(shí)期豬肝，E30(n=1)，E110（n=2)，出生后不同時(shí)期豬肝D240(n=2)，D488(n=1)。

單細(xì)胞核ATAC，D240(n=1)。

研究?jī)?nèi)容總結(jié)：

① 構(gòu)建迄今最全面的出生后豬肝臟單細(xì)胞發(fā)育圖譜，涵蓋斷奶前（30天）、斷奶后（42天）、生長(zhǎng)高峰（150天）和成年階段（730天）這四個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育重要階段，數(shù)據(jù)涵蓋單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組以及單細(xì)胞ATAC數(shù)據(jù)，共鑒定到23種細(xì)胞類型，包括肝臟中的三種稀有細(xì)胞類型，漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（pDCs），CAVIN3+IGF2+內(nèi)皮細(xì)胞和EBF1+成纖維細(xì)胞。

② 發(fā)現(xiàn)斷奶前仔豬和成年豬脂肪酸合成的差異，擬時(shí)序分析鑒定出5693個(gè)基因在三個(gè)發(fā)育階段表現(xiàn)出顯著表達(dá)水平變化，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)33個(gè)階段特異性轉(zhuǎn)錄因子，例如D30富集參與調(diào)節(jié)出生后肝細(xì)胞成熟的轉(zhuǎn)錄因子EZH2，D42富集參與調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律的CLOCK，還首次鑒定出成年豬肝竇內(nèi)皮特異性的轉(zhuǎn)錄因子LUAP2。通路富集分析結(jié)果顯示不同發(fā)育階段肝竇內(nèi)皮細(xì)胞富集的通路不同，D40是免疫相關(guān)通路富集，D730中主要是代謝相關(guān)通路基因表達(dá)上調(diào)。

③ 豬D30免疫細(xì)胞主要是NK（自然殺傷細(xì)胞）和T細(xì)胞，以往有報(bào)道表明新生小鼠免疫系統(tǒng)重髓系細(xì)胞占比更大，出生D30豬肝臟免疫系統(tǒng)可能發(fā)生了從髓系細(xì)胞到淋巴系細(xì)胞的免疫系統(tǒng)轉(zhuǎn)變。此外，豬trNK（組織駐留自然殺傷細(xì)胞）具有與人類相似的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)特征，或表明豬可以作為研究人trNK的理想模型。

圖5-單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）和單核RNA測(cè)序（snRNA-seq）鑒定發(fā)育中肝臟細(xì)胞類型

6.豬腎異種移植排異的時(shí)空?qǐng)D譜

英文標(biāo)題：Spatiotemporal immune atlas of a clinicalgrade gene-edited pig-to-human kidney xenotransplant

發(fā)表期刊：Nature Communications

影響因子：14.7

發(fā)布時(shí)間：2024-04

DOI：10.1038/s41467-024-47454-7

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)空部分：

單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組，移植前豬腎穿刺組織，移植后24h/72h/74h豬腎穿刺組織（n=4）。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，移植74h后切除的腎組織CD45+細(xì)胞（n=1）；

空間轉(zhuǎn)錄組，移植前豬腎穿刺組織，移植后24h/72h/74h豬腎穿刺組織（n=4）。

研究?jī)?nèi)容總結(jié)：

① 基因編輯豬腎移植給腦死亡且雙腎切除患者。數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，未在異種移植后的豬腎組織中發(fā)現(xiàn)急性細(xì)胞排異或IgM/IgG/配體蛋白結(jié)合的證據(jù)，但發(fā)現(xiàn)急性腎小管壞死和病因不明的血栓性微血管病變。

② 移植后豬腎中髓系細(xì)胞是人和豬腎中檢測(cè)到的最多的免疫細(xì)胞，移植3天內(nèi)人B細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞很少檢測(cè)到，3天后檢測(cè)到的人免疫細(xì)胞增多但豐度遠(yuǎn)小于豬免疫細(xì)胞。

③ 移植3天后發(fā)現(xiàn)人類中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞主要與豬內(nèi)皮細(xì)胞共定位，人巨噬細(xì)胞主要與豬基質(zhì)細(xì)胞共定位，表明人免疫細(xì)胞對(duì)豬腎皮質(zhì)浸潤(rùn)有限。

④ 移植豬腎中人和豬巨噬細(xì)胞更傾向于激活抗炎癥基因表達(dá)。

圖6-人髓系細(xì)胞對(duì)豬腎異種移植的有限浸潤(rùn)

7.豬空腸免疫細(xì)胞單細(xì)胞圖譜

?

英文標(biāo)題：Single-Cell Transcriptional Analysis of Lamina Propria Lymphocytes in the Jejunum Reveals Innate Lymphoid Celllike Cells in Pigs

發(fā)表期刊：The Journal of Immunology

發(fā)布時(shí)間：2024-01

DOI：10.4049/jimmunol.2300463

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)空部分：

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，4周大仔豬，空腸固有層淋巴細(xì)胞（n=3），空腸先天淋巴樣細(xì)胞（n=3）。

研究?jī)?nèi)容總結(jié)：

① 單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析顯示，豬腸道ILC（先天淋巴樣細(xì)胞）主要包括ILC3、ILC1、ILC2以及NC細(xì)胞，其中ILC3是豬空腸LPL（固有層淋巴細(xì)胞）中主要的ILC，進(jìn)一步分析揭示ILC3有4種亞群，但沒有在豬ILC中發(fā)現(xiàn)LTi（淋巴組織誘導(dǎo)細(xì)胞）。

② 豬空腸ILC標(biāo)志基因與人基因相似，包括IL-23R、AHR、NCR2等。此外，研究者發(fā)現(xiàn)ILC3可能分化成ILC2、ILC1和NK細(xì)胞。ILC3亞群種，ILC3b沒有明顯高表達(dá)基因，是ILC亞群中具有更高轉(zhuǎn)分化可塑性的亞群，IKZF1和TGFB1可能與該過程有關(guān)。

③ 豬ILC3表達(dá)TAC3基因，該基因編碼蛋白的受體是NK3R，可以促進(jìn)釋放促性腺激素釋放激素，繼而促進(jìn)性激素釋放，因此TAC3在促性腺激素軸上起到重要作用，因而可能存在腸/性腺軸，暗示豬腸道ILC3或調(diào)控性腺發(fā)育。

④ 與小鼠相比，人類和豬腸道ILC轉(zhuǎn)錄上是保守的，一些ILC標(biāo)志基因在人、豬和小鼠中都表達(dá)，但豬空腸ILC中也發(fā)現(xiàn)一些特異性表達(dá)基因。人類和豬腸道ILC組成高度相似（主要是ILC3，ILC2幾乎不存在），但小鼠中ILC2占比高?？傊琁LC的跨物種數(shù)據(jù)分析和比較，為后續(xù)豬作為人類醫(yī)學(xué)研究模型提供了基礎(chǔ)，特別是關(guān)注ILC相關(guān)細(xì)胞和腸粘膜免疫疾病的研究。

圖7-豬空腸中l(wèi)LC3s的分型研究

8.感染PEDV仔豬的空腸單細(xì)胞圖譜

?

英文標(biāo)題：Identification of Cell Types and Transcriptome Landscapes of Porcine Epidemic Diarrhea VirusInfected Porcine Small Intestine Using Single-Cell RNA Sequencing

發(fā)表期刊：The Journal of Immunology

發(fā)布時(shí)間：2023-02

DOI：10.4049/jimmunol.2101216

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)空部分：

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，口服2ml PEDV-24h的3天大仔豬（n=1,4只豬樣本混合），口服對(duì)照液體-24h的3天大仔豬（n=1,4只豬樣本混合）

研究?jī)?nèi)容總結(jié)：

① 首次繪制感染PEDV（豬流行性腹瀉病毒）的仔豬小腸單細(xì)胞圖譜，使用人小腸細(xì)胞類型marker鑒定出12種細(xì)胞類型，發(fā)現(xiàn)豬小腸tuft細(xì)胞新特異性標(biāo)志基因DNAH11，結(jié)果表明多數(shù)人小腸特異性marker也可以用到豬研究中。此外，豬小腸Th17細(xì)胞（3和9簇）特異性高表達(dá)IL17A、IL7F和IL22，但不高表達(dá)T細(xì)胞代表性CD3，這可能與豬T細(xì)胞分化有關(guān)。

② 抗菌肽（AMP）相關(guān)基因分析結(jié)果顯示，僅DEFB115和REG3G在仔豬空腸部分的腸細(xì)胞中最為豐富，PEDV感染會(huì)導(dǎo)致REG3G顯著上調(diào)。REG3G表達(dá)與IL33、MyD88、STAT3等相關(guān)，在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)感染PEDV后IPEC-J2細(xì)胞IL33表達(dá)水平以及STAT3磷酸化水平顯著增加，表明IL33-STAT3信號(hào)通路可能在PEDV感染誘導(dǎo)的REG2G表達(dá)中起到重要作用。

③ 功能富集分析結(jié)果顯示，病毒感染導(dǎo)杯狀細(xì)胞、tuft細(xì)胞和腸內(nèi)分泌細(xì)胞中緊密連接和粘附連接通路水平顯著降低，體外實(shí)驗(yàn)確認(rèn)PEDV感染的IPEC-J2細(xì)胞中，緊密連接通路相關(guān)基因表達(dá)顯著降低，但感染晚期粘附連接通路相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平表達(dá)顯著增加，這可能是由于不同腸細(xì)胞類型對(duì)PEDV感染的不同響應(yīng)導(dǎo)致的。冠狀病毒受體分析結(jié)果表明，豬小腸上皮細(xì)胞高表達(dá)多種不同的冠狀面病毒受體，這一發(fā)現(xiàn)支持豬易受冠狀病毒感染并表現(xiàn)感染相關(guān)腸道癥狀。

圖8-豬小腸空腸段細(xì)胞類型的測(cè)定

同源器官比較

9.脊椎動(dòng)物肺單細(xì)胞圖譜

英文標(biāo)題：Origin and stepwise evolution of vertebrate lungs

發(fā)表期刊：Nature ecology & evolution

影響因子：14.1

發(fā)布時(shí)間：2025-2

DOI：10.1038/s41559-025-02642-6

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)空部分：

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序：

塞內(nèi)加爾多鰭魚，肺（n=2），腦/食管/鰓/心臟/腸/肌肉/胃（各器官，n=1）；

非洲肺魚，肺（n=2），腦/食管/鰓/心臟/腸/腎/肌肉/皮膚/胃（各器官，n=1）；

條紋斑竹鯊，壺腹/魚鰭/心臟/腸/胰腺/鰓/牙（各器官，n=3），腦/食管/腎（各器官，n=2），脾臟（n=6），眼睛（n=1）；雞肺，E6/E7/P3（各時(shí)期，n=1）；

非洲牛蛙肺（n=2）；鬃獅蜥肺（n=1）。

人/小鼠/大鼠/豬的肺數(shù)據(jù)使用已有的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)。

百邁客生物為塞內(nèi)加爾多鰭魚和非洲肺魚除肺以外的組織，提供了百創(chuàng)DG1000單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序服務(wù)。

研究?jī)?nèi)容總結(jié)：

① 使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析9種動(dòng)物的成體/胚胎肺組織及其他組織，發(fā)現(xiàn)軟骨魚具有多個(gè)肺發(fā)育所必須得遺傳組分，包括肺特異性基因，但不同物種中這些基因的表達(dá)模式和功能可能有差異，表明軟骨魚距離擁有肺在“進(jìn)化上只差一步之遙”；軟骨魚食管和胃中，少量細(xì)胞共表達(dá)對(duì)呼吸脊椎動(dòng)物肺功能十分重要的sftpb和abca3基因，暗示頜類脊椎動(dòng)物最近共同祖先（LCA）經(jīng)歷顯著的演化變化，不僅發(fā)育出重要特征如頜和成對(duì)附件，還為肺最終出現(xiàn)奠定基礎(chǔ)。

② 許多保守的非編碼組分（CNE）來源于頜類脊椎動(dòng)物祖先，暗示肺的遺傳基礎(chǔ)可能在脊椎動(dòng)物演化很早就出現(xiàn)，但無肺蠑螈中缺失的CNE與其促肺活性無關(guān)，表明這些組分可能還具有除肺發(fā)育以外的多種功能；硬骨魚祖先來源的CNE在無肺蠑螈表現(xiàn)出更高的丟失率，也反映出這些CNE具有顯著的肺功能特異性，強(qiáng)調(diào)了復(fù)雜器官起源中調(diào)控組分演化的重要性。這些證據(jù)暗示肺起源的兩個(gè)階段過程，最開始頜類脊椎動(dòng)物L(fēng)CA出現(xiàn)基礎(chǔ)的肺相關(guān)遺傳組分，隨后譜系演化出更特異性的肺增強(qiáng)子產(chǎn)生硬骨魚；功能完全的肺可能在軟骨魚和硬骨魚譜系分開后演化而來。

③ 全基因組復(fù)制對(duì)肺演化很重要，1866個(gè)肺相關(guān)直系同源基因中有776個(gè)是脊椎動(dòng)物兩輪全基因組復(fù)制（2R-WGD）的產(chǎn)物；哺乳動(dòng)物譜系特異的基因復(fù)制也十分重要，sfta2-/-小鼠表現(xiàn)出明顯的呼吸疾病，包括顯著的炎癥。

④ 研究成果支持了兩個(gè)關(guān)于復(fù)雜器官的前期假設(shè)。首先，肺進(jìn)化是一個(gè)逐步過程，與達(dá)爾文預(yù)測(cè)相一致，與眼睛和其他器官類似，肺演化似乎是隨時(shí)間逐漸發(fā)生的。其次，反映了Jacob定律，即演化類似“修補(bǔ)匠”，使用已有的遺傳基礎(chǔ)，包括招募、征用已經(jīng)存在的基因和調(diào)控組分?？傊@些結(jié)果表明調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的修改對(duì)肺的起源和演化是十分重要的，新基因或基因重復(fù)的出現(xiàn)提供了基礎(chǔ)材料，即使這些基因并不會(huì)立刻發(fā)揮作用。

10.野豬/萊蕪豬/杜洛克豬新生骨骼肌單細(xì)胞圖譜

英文標(biāo)題：Single-Cell RNA-Sequencing Provides Insight into Skeletal Muscle Evolution during the Selection of Muscle Characteristics

發(fā)表期刊：Advanced Science

影響因子：14.3

發(fā)布時(shí)間：2023-10

DOI：10.1002/advs.202305080實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)空部分：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，<3天雄性仔豬背闊肌，野豬（n=3），萊蕪豬（n=3），杜洛克豬（n=3）。

研究?jī)?nèi)容總結(jié)：

① 使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)繪制了野豬、萊蕪豬和杜洛克豬新生骨骼肌駐留細(xì)胞圖譜，鑒定出9種細(xì)胞類型，包括成肌細(xì)胞、肌細(xì)胞、衛(wèi)星細(xì)胞等，定義兩種新亞型，MT豐富FAP（?bro-adipogenic progenitors）以及肌細(xì)胞樣FAP。

② 與不同物種的胎兒和成體骨骼肌相比，豬新生骨骼肌細(xì)胞組成類型更豐富。例如，豬新生骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞不僅包含衛(wèi)星干細(xì)胞（PAX7+），還包括兩個(gè)有不同肌源性潛能的亞群（HES1+和TRIB1+衛(wèi)星細(xì)胞）；少有研究可解答骨骼肌中FAP的異質(zhì)性，但本研究發(fā)現(xiàn)4種FAP亞群。與人、小鼠骨骼肌數(shù)據(jù)聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)豬骨骼肌駐留細(xì)胞的通用marker和物種特異性的marker。

③ 豬新生骨骼肌中發(fā)現(xiàn)增殖分化活性狀態(tài)的干性樣細(xì)胞，如pro-NK/T、間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）、間質(zhì)細(xì)胞等，且MSC和FAP間存在一群具有典型標(biāo)志基因如CD73、CD90和PDGFRA的連續(xù)態(tài)細(xì)胞亞群。此外，擬時(shí)序分析揭示杜洛克豬新生骨骼肌中的成肌譜系干細(xì)胞處于初始階段，野豬的成肌譜系已處于分化末期和成熟期，萊蕪豬位于中間態(tài)。

④ 不同品種豬具有不同骨骼肌表型，它們骨骼肌駐留細(xì)胞譜系存在一定差異。與家豬相比，野豬缺少兩種FAP亞群，但存在THY1+衛(wèi)星細(xì)胞；發(fā)現(xiàn)品種特異性細(xì)胞類型，例如萊蕪豬具有COL13A1+ 腱細(xì)胞；與萊蕪豬和野豬相比，杜洛克豬新生肌肉中具有更多增殖的前體脂肪細(xì)胞，或意味杜洛克豬未來選育后可積累更高的IMF（肌內(nèi)脂肪）。

圖9-野豬、萊蕪豬和杜洛克豬骨骼肌細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜分析

11.人/小鼠/大鼠/豬胃竇跨物種比較單細(xì)胞圖譜

英文標(biāo)題：Cross-species single-cell transcriptomic analysis of animal gastric antrum reveals intense porcine mucosal immunity

發(fā)表期刊：Cell Regeneration

發(fā)布時(shí)間：2023-08

DOI：10.1186/s13619-023-00171-w

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)空部分：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，人（n=4），小鼠（n=3），大鼠（n=3），豬（n=3）。

研究?jī)?nèi)容總結(jié)：

① 使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)構(gòu)建人、豬、大鼠和小鼠的胃竇單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，鑒定出9種類型的細(xì)胞，包括小凹黏膜細(xì)胞、小凹祖細(xì)胞、基底腺粘液細(xì)胞等。絕大多數(shù)類型的細(xì)胞存在于兩個(gè)或者多個(gè)物種中，F(xiàn)3和CLCA1低表達(dá)水平的祖細(xì)胞僅在人類和豬的胃竇上皮中發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)F3的基底粘液腺細(xì)胞僅在豬胃竇上皮中發(fā)現(xiàn)，通路富集分析表明F3+細(xì)胞類群可能與細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖以及蛋白穩(wěn)定維持相關(guān)。

② 功能富集分析結(jié)果表明，人的胃竇上皮高表達(dá)金屬離子穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因，豬的胃竇上皮高表達(dá)免疫相關(guān)基因，大鼠和小鼠的胃竇上皮高表達(dá)脂代謝相關(guān)基因，這種差異可能是由于飲食習(xí)慣導(dǎo)致的。豬胃竇上皮類器官bulk RNA-seq數(shù)據(jù)也確認(rèn)這一發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步的豬胃竇上皮細(xì)胞類器官體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TNFα能夠特異性地上調(diào)T細(xì)胞和B細(xì)胞活化相關(guān)基因，這些結(jié)果表明，正常生理狀態(tài)下豬胃竇上皮細(xì)胞具有強(qiáng)免疫能力，可能與其復(fù)雜飲食習(xí)慣和居住環(huán)境有關(guān)。

③ 進(jìn)一步分析人和豬胃竇中的免疫細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)人胃竇免疫細(xì)胞高表達(dá)B細(xì)胞/T細(xì)胞激活和功能相關(guān)基因，而豬胃竇顯著高表達(dá)B細(xì)胞/T細(xì)胞細(xì)胞增殖相關(guān)基因；細(xì)胞通訊分析結(jié)果顯示，人胃竇中上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞間高表達(dá)或特異性表達(dá)免疫細(xì)胞產(chǎn)生、成熟、維持和功能相關(guān)受配體對(duì)，而豬中主要是與上皮細(xì)胞生長(zhǎng)分化、抗炎癥和抗菌、免疫細(xì)胞增殖相關(guān)。

圖10-scRNA-seq分析揭示了人、豬大鼠和小鼠胃竇細(xì)胞組成及基因表達(dá)譜

12.豬器官全景單細(xì)胞圖譜

英文標(biāo)題：Endothelial cell heterogeneity and microglia regulons revealed by a pig cell landscape at single-cell level

發(fā)表期刊：Nature Communications

影響因子：14.7

發(fā)布時(shí)間：2022-06

DOI：10.1038/s41467-022-31388-z

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)空部分：

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，6個(gè)月大豬，肝（n=1），血液PBMC（n=1），視網(wǎng)膜（n=1），脾臟（n=1），腸道（n=1），肺（n=1），脂肪組織（n=2）。

單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組，6個(gè)月大豬，腦（n=9），視網(wǎng)膜（n=1)，腎臟（n=1），心臟（n=1），脾臟（n=1），肝臟（n=1），肺（n=1）。

研究?jī)?nèi)容總結(jié)：

① 使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，構(gòu)建首個(gè)家豬多器官單細(xì)胞圖譜，得到234種降維聚類簇，鑒定出58種細(xì)胞類型及其相關(guān)的顯著富集標(biāo)志基因，搭建了可視化家豬單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)（Pig Single Cell Atlas Database）。

② 對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析，鑒定出21種具有特異表達(dá)特征和功能的血管內(nèi)皮細(xì)胞類型，包括脂肪組織中依賴于TGF-b2信號(hào)通路內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化亞型；人/豬肝臟、腎臟和心臟組織中，內(nèi)皮細(xì)胞主要通過VEGF、PDGF，TGF-β和BMP通路與其他細(xì)胞類型互作，但不同細(xì)胞類型的互作通路有差異，例如豬內(nèi)皮細(xì)胞可與肝臟免疫細(xì)胞、心臟所有細(xì)胞細(xì)胞類型通過PDGF交流，但在腎臟中可通過PDGF通路與內(nèi)皮細(xì)胞交流的僅有足細(xì)胞。總之，這些結(jié)果表明家豬單細(xì)胞圖譜為研究豬或人組織中細(xì)胞間互作提供了有參考價(jià)值的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

③ 對(duì)家豬、人、小鼠、猴、倉(cāng)鼠、栗鼠、鼴鼠等13個(gè)物種的大腦小膠質(zhì)細(xì)胞單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)1590個(gè)保守的轉(zhuǎn)錄組因子（TF）靶向?qū)?，其中MEF2C、SPI1、IRF8、ZFP36L1在13個(gè)物種的小膠質(zhì)細(xì)胞中均高表達(dá)，這些結(jié)果表明家豬單細(xì)胞圖譜為研究不同物種小膠質(zhì)細(xì)胞保守和差異的遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對(duì)未來腦小膠質(zhì)細(xì)胞功能研究發(fā)展具有重要意義。

圖11-豬20種組織單細(xì)胞圖譜

從以上文章可以看到，豬相關(guān)研究除了養(yǎng)殖、繁育、品種優(yōu)化、營(yíng)養(yǎng)學(xué)、表型性狀、遺傳演化等方面，生殖、發(fā)育、衰老、損傷與修復(fù)、異種移植、神經(jīng)學(xué)等方向研究成果也具有較高參考和轉(zhuǎn)化價(jià)值。未來，可能會(huì)出現(xiàn)豬睪丸、胚胎發(fā)育、心血管組織、腦組織、疾病模型、異種移植/同種異體移植、鼻嗅覺、舌味覺、免疫系統(tǒng)等方向的研究成果。

Ps：關(guān)注時(shí)空組學(xué)在豬領(lǐng)域研究請(qǐng)聯(lián)系當(dāng)?shù)貥I(yè)務(wù)經(jīng)理獲取原文~

1. Ge W, Niu YL, et al. Spatiotemporal dynamics of early oogenesis in pigs. Genome Biol. 2025 Jan 2;26(1):2.

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近年來，光合作用作為植物生命活動(dòng)的核心環(huán)節(jié)，與糧食安全、能源開發(fā)及氣候變化等全球性挑戰(zhàn)密切相關(guān)，備受科學(xué)界和行業(yè)的高度關(guān)注。時(shí)空組學(xué)技術(shù)是近年來比較火熱的技術(shù)之一，在植物領(lǐng)域的應(yīng)用廣泛且深入，該技術(shù)通過同時(shí)獲取細(xì)胞的空間位置信息和基因表達(dá)數(shù)據(jù)，為理解植物組織生長(zhǎng)發(fā)育、生理生化、抗逆應(yīng)激、生物進(jìn)化等多個(gè)方面提供了重要的研究手段。

于是，我問DeepSeek：植物如何利用時(shí)空組學(xué)進(jìn)行光合作用研究？

植物利用時(shí)空組學(xué)（Spatio-Temporomics）研究光合作用，主要通過整合空間組學(xué)（空間分辨的分子數(shù)據(jù)）和時(shí)間組學(xué)（動(dòng)態(tài)變化的分子數(shù)據(jù)），揭示光合作用相關(guān)基因、蛋白質(zhì)、代謝物等在時(shí)間和空間上的協(xié)同調(diào)控機(jī)制。以下是具體研究方向和技術(shù)的應(yīng)用：1.空間組學(xué)解析光合作用的細(xì)胞/組織異質(zhì)性

• 空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)：

利用單細(xì)胞或空間分辨轉(zhuǎn)錄組技術(shù)（如10x Genomics Visium、MERFISH），定位光合作用相關(guān)基因（如編碼光系統(tǒng)蛋白的基因、卡爾文循環(huán)酶基因）在葉片不同細(xì)胞類型（葉肉細(xì)胞、維管束鞘細(xì)胞）或不同組織區(qū)域的表達(dá)差異。例如，C4植物中光合基因在葉肉細(xì)胞和維管束鞘細(xì)胞中的空間特異性表達(dá)。

• 空間蛋白質(zhì)組學(xué)：

通過質(zhì)譜成像（MALDI-MSI）或熒光標(biāo)記技術(shù)，研究光合作用關(guān)鍵蛋白（如Rubisco、PSII復(fù)合體）在葉綠體基質(zhì)、類囊體膜等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的分布，以及光強(qiáng)變化對(duì)蛋白定位的影響。

• 空間代謝組學(xué)：

分析光合中間產(chǎn)物（如ATP、NADPH、蔗糖）在葉片不同區(qū)域的動(dòng)態(tài)積累，揭示光合同化產(chǎn)物（如淀粉、糖）的運(yùn)輸與分配機(jī)制。

2.時(shí)間組學(xué)揭示光合作用的動(dòng)態(tài)調(diào)控

• 晝夜節(jié)律與光響應(yīng)：

通過時(shí)間序列轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，研究光合作用基因（如LHCB、PIFs）在晝夜周期中的表達(dá)波動(dòng)，以及光信號(hào)（如紅光、藍(lán)光）如何通過生物鐘調(diào)控光合效率。

• 發(fā)育階段動(dòng)態(tài)：

比較幼苗、成熟葉、衰老葉中光合相關(guān)基因的時(shí)序表達(dá)模式，揭示葉綠體發(fā)育（如原質(zhì)體分化）和衰老過程中光合能力的動(dòng)態(tài)變化。

• 環(huán)境脅迫響應(yīng)：

分析高溫、干旱或高光脅迫下，植物光合作用相關(guān)基因和代謝物的短期（分鐘級(jí)）和長(zhǎng)期（數(shù)天）響應(yīng)，例如光保護(hù)機(jī)制（非光化學(xué)淬滅，NPQ）的動(dòng)態(tài)調(diào)控。

3.時(shí)空整合解析光合作用的協(xié)同網(wǎng)絡(luò)

• 多組學(xué)整合：

結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和代謝組數(shù)據(jù)，構(gòu)建光合作用基因-酶-代謝物的時(shí)空調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。例如，光合同化產(chǎn)物（如蔗糖）的輸出如何與維管組織發(fā)育相關(guān)聯(lián)。

• 細(xì)胞間通訊研究：

利用空間組學(xué)數(shù)據(jù)，分析葉肉細(xì)胞與維管束鞘細(xì)胞之間的代謝物交換（如C4植物的CO2濃縮機(jī)制），或共生微生物（如固氮菌）如何影響宿主光合作用。

• 3D時(shí)空建模：

通過計(jì)算模型模擬葉片中光梯度、CO2擴(kuò)散與光合基因表達(dá)的空間耦合關(guān)系，預(yù)測(cè)最優(yōu)光合效率的葉片結(jié)構(gòu)。

4.應(yīng)用場(chǎng)景與案例

• C3與C4植物比較：

時(shí)空組學(xué)可揭示C4植物光合細(xì)胞分工（Kranz結(jié)構(gòu)）的進(jìn)化機(jī)制，例如PEP羧化酶在維管束鞘細(xì)胞中的特異性表達(dá)。

• 作物改良：

通過篩選光合效率時(shí)空差異的基因（如調(diào)控氣孔開閉的基因），設(shè)計(jì)高光效作物品種。

• 極端環(huán)境適應(yīng)：

研究荒漠植物（如仙人掌）如何在干旱條件下時(shí)空調(diào)控光合相關(guān)基因，減少水分流失。

5.技術(shù)挑戰(zhàn)與未來方向

• 技術(shù)限制：

當(dāng)前空間組學(xué)分辨率（單細(xì)胞/亞細(xì)胞級(jí)別）和通量仍需提升，尤其是葉綠體內(nèi)分子動(dòng)態(tài)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

• C3與C4植物比較：

跨尺度（分子-細(xì)胞-組織）和多組學(xué)數(shù)據(jù)的整合分析需要更強(qiáng)大的算法支持。

• 活體動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)：

開發(fā)非侵入式成像技術(shù)（如熒光報(bào)告系統(tǒng)），實(shí)時(shí)追蹤光合作用相關(guān)分子的時(shí)空動(dòng)態(tài)。

DeepSeek提到的當(dāng)前空間組學(xué)分辨率（單細(xì)胞/亞細(xì)胞級(jí)別）和通量的限制，百邁客生物已經(jīng)進(jìn)行了優(yōu)化提升，推出了百創(chuàng)S3000空間轉(zhuǎn)錄組芯片（捕獲區(qū)面積：6.8*6.8mm2，相鄰兩個(gè)捕獲位點(diǎn)的中心距為3.5μm）。該芯片具有高基因捕獲效率，搭配植物多尺度細(xì)胞分割技術(shù)，部分植物組織單個(gè)細(xì)胞中位基因數(shù)可達(dá)1000+，基因捕獲能力媲美單細(xì)胞測(cè)序。

關(guān)于應(yīng)用方向場(chǎng)景案例，DeepSeek究竟說的對(duì)不對(duì)？

我們還需要結(jié)合已發(fā)表的文獻(xiàn)看一看，于是小編又下載盤點(diǎn)了7篇植物光合作用方向的時(shí)空組學(xué)文章，這些成果發(fā)表期刊有Nature(IF=50.5)與預(yù)印本系統(tǒng)bioRxiv。研究的物種涉及水稻、高粱、玉米、狗尾草、黍、冰葉日中花、Urochloa fusca、堇娘芥等，涉及組織部位主要是幼苗葉片、葉原基等。

接下來，我們一起來看看植物光合作用方向的時(shí)空組學(xué)應(yīng)用進(jìn)展吧！

1.祖先細(xì)胞身份網(wǎng)絡(luò)的擴(kuò)展驅(qū)動(dòng)C4光合作用的進(jìn)化

英文標(biāo)題：Exaptation of ancestral cell-identity networks enables C4?photosynthesis發(fā)表期刊：Nature

影響因子：50.5

物種樣本：水稻（Oryza sativa，C3植物）、高粱（Sorghum bicolor，C4植物）

測(cè)序策略：單細(xì)胞核RNA測(cè)序、單細(xì)胞核多組學(xué)測(cè)序、高分辨率sci-RNA-seq3技術(shù)

DOI：https://doi.org/10.1038/s41586-024-08204-3

發(fā)表時(shí)間：2024.11.20

取樣策略：

單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組：水稻和高粱幼苗暗生長(zhǎng)5天后，在光周期（12h光/12h暗）中采集0h（暗）、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、48h共9個(gè)時(shí)間點(diǎn)的地上組織?？傆?jì)水稻190,569個(gè)核、高粱265,701個(gè)核。

圖1-水稻和高粱單細(xì)胞測(cè)序取樣過程示意圖

① 地球上大多數(shù)高產(chǎn)植物通過C4途徑進(jìn)行光合作用，相較于原始的C3途徑，C4途徑的光合效率提高了50%。維管束鞘細(xì)胞在激活光合作用中扮演了關(guān)鍵角色。然而，維管束鞘細(xì)胞如何執(zhí)行光合調(diào)控功能尚不明確。

② 該研究通過單細(xì)胞RNA測(cè)序(sc-RNAseq)和單細(xì)胞轉(zhuǎn)座酶可及性染色質(zhì)測(cè)序(sc-ATACseq)，揭示了C4葉片中維管束鞘細(xì)胞基因表達(dá)的變化與C3葉片中已知的順式調(diào)控元件相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在C3植物水稻和C4植物高粱中，DOF motif在維管束鞘細(xì)胞中定位，并能調(diào)控光合作用的發(fā)展。在高粱中，大多數(shù)受光合作用調(diào)控的高表達(dá)基因都受到DOF motif的調(diào)控。這些轉(zhuǎn)錄因子在不同細(xì)胞間穩(wěn)定表達(dá)，并能在C3和C4植物葉片的維管束鞘細(xì)胞中激活光合作用。

③ 該研究結(jié)果為理解復(fù)雜的C4途徑進(jìn)化提供了分子層面的見解，并為指導(dǎo)C3和C4作物的生長(zhǎng)發(fā)育提供了理論基礎(chǔ)。

圖2-水稻和高粱幼苗去黃化過程中單細(xì)胞核的基因表達(dá)和染色質(zhì)可及性

2.禾本科植物單細(xì)胞分辨率下C3與C4光合作用順式調(diào)控基礎(chǔ)研究

英文標(biāo)題：Investigating the cis-Regulatory Basis of?C3?and?C4?Photosynthesis in Grasses at Single-Cell Resolution發(fā)表期刊：bioRxiv

物種樣本：C4植物：玉米（Zea mays，NADP-ME型）、高粱（Sorghum bicolor，NADP-ME型）、黍（Panicum miliaceum，NAD-ME型）、Browntop Signalgrass（Urochloa fusca，PEPCK型）；對(duì)照C3植物：水稻（Oryza sativa）

測(cè)序策略：sciATAC-seq

DOI：https://doi.org/10.1101/2024.01.05.574340

發(fā)布時(shí)間：2024.01.05

取樣策略：

發(fā)育階段：C4物種取第三葉展開期葉片，C3水稻取18天齡葉片；

技術(shù)重復(fù)：每個(gè)物種設(shè)置生物學(xué)重復(fù)，總計(jì)玉米16,060核、高粱15,301核、黍7,081核、Browntop Signalgrass共19,110核、水稻5,952核。

① 盡管關(guān)于C4光合作用關(guān)鍵酶的研究已經(jīng)有了相當(dāng)多的認(rèn)識(shí)，但對(duì)于在特定細(xì)胞類型中指定其表達(dá)的重要順式調(diào)控機(jī)制（cis-regulation）的了解卻少之又少。

② 該研究使用單細(xì)胞sci-ATAC-seq來鑒定與C4酶相關(guān)的特異細(xì)胞類型的可及染色質(zhì)區(qū)域（ACRs），研究涵蓋了五種不同的禾本科植物，包括四種C4植物和一種C3植物。其中，C4植物分屬三種不同的光合亞型：玉米（Zea mays）和高粱（Sorghum bicolor）屬于NADP-ME亞型；黍（Panicum miliaceum）屬于NAD-ME亞型；Urochloa fusca屬于PEPCK亞型；C3植物水稻（Oryza sativa）

③ 該研究繪制了所有C4植物中必需酶和各C4亞型特有酶的cis-調(diào)控圖譜，并使用染色質(zhì)可及性數(shù)據(jù)測(cè)量C4酶的特定細(xì)胞類型偏好。將這些數(shù)據(jù)與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)相結(jié)合，揭示了物種間基因家族成員的多樣化共選擇，展示了C4進(jìn)化的不同路徑。除了啟動(dòng)子近端ACRs，研究發(fā)現(xiàn)C4基因平均每個(gè)都有兩到三個(gè)遠(yuǎn)端特異性細(xì)胞類型的ACRs，這突出了C4進(jìn)化的復(fù)雜性和多樣性。在研究這些特異性細(xì)胞類型ACRs的進(jìn)化歷史時(shí)，發(fā)現(xiàn)即使在密切相關(guān)的物種中，也存在從保守到新穎的ACRs光譜，表明這些C4位點(diǎn)的順式調(diào)控正在持續(xù)進(jìn)化。

④ 該研究揭示了C4光合作用關(guān)鍵基因位點(diǎn)的順式調(diào)控進(jìn)化動(dòng)態(tài)和復(fù)雜性，尤其強(qiáng)調(diào)了這些位點(diǎn)的精細(xì)化順式調(diào)控進(jìn)化。研究成果為未來進(jìn)一步探索提供了重要資源，可能有助于在氣候變化條件下優(yōu)化C3作物的性能。

圖3-在單細(xì)胞分辨率下對(duì)不同作物的細(xì)胞類型注釋

3.單細(xì)胞分辨率下冰葉日中花CAM誘導(dǎo)的葉肉特異性晝夜動(dòng)態(tài)

英文標(biāo)題：Mesophyll-Specific Circadian Dynamics of CAM Induction in the Ice Plant Unveiled by Single-Cell Transcriptomics發(fā)表期刊：bioRxiv

物種樣本：冰葉日中花（Mesembryanthemum crystallinum，兼性CAM植物）

測(cè)序策略：單細(xì)胞核RNA測(cè)序、Iso-Seq全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、基因組組裝

DOI：https://doi.org/10.1101/2024.01.05.574430

發(fā)布時(shí)間：2024.01.05

取樣策略：

處理?xiàng)l件：鹽脅迫組：5周齡植株經(jīng)0.5M NaCl處理8天；

對(duì)照組：正常灌溉植株；

時(shí)間點(diǎn)：光周期（12h光/12h暗）中采集黎明（Dawn）和黃昏（Dusk）樣本，鹽處理組與對(duì)照組各取2個(gè)時(shí)間點(diǎn)，共4組樣本的葉片；

單細(xì)胞核測(cè)序：共獲取17,994個(gè)高質(zhì)量核，注釋17個(gè)細(xì)胞簇，覆蓋葉肉（海綿/柵欄）、表皮、保衛(wèi)細(xì)胞、木質(zhì)部、韌皮部等

① 景天酸代謝（Crassulacean acid metabolism, CAM）是C3光合作用二氧化碳固定途徑的一個(gè)進(jìn)化改良形式，大約有7%的陸生植物通過這種方式適應(yīng)干旱環(huán)境?？烧T導(dǎo)型CAM植物，例如冰葉日中花（Mesembryanthemum crystallinum，普通冰草），擁有一種獨(dú)特的能力，能夠在高鹽度和水分不足的脅迫下從C3光合作用切換到CAM光合作用。

② 該研究通過單核RNA測(cè)序（snRNA-seq），結(jié)合一個(gè)全新高質(zhì)量組裝和注釋的基因組，對(duì)冰草從C3到CAM的環(huán)境誘導(dǎo)轉(zhuǎn)變進(jìn)行了表征，以識(shí)別其潛在的調(diào)控因子。針對(duì)在黎明和黃昏采集的冰草葉片在C3和CAM切換過程中單核RNA測(cè)序數(shù)據(jù)的分析，揭示了在CAM誘導(dǎo)初期葉肉細(xì)胞中存在顯著的轉(zhuǎn)錄變化。

③ 值得注意的是，該研究發(fā)現(xiàn)標(biāo)明了黃昏時(shí)參與CAM或C3光合作用的不同葉肉亞細(xì)胞類型。細(xì)胞軌跡推斷分析重建了全天候（24小時(shí)）的CAM和C3周期，直接比較了兩條途徑中的基因表達(dá)譜。這項(xiàng)對(duì)比研究揭示了CAM和C3細(xì)胞軌跡中關(guān)鍵晝夜節(jié)律基因的不同表達(dá)模式，表明晝夜節(jié)律調(diào)控與CAM的誘導(dǎo)之間存在聯(lián)系。

圖4-所有四個(gè)snRNAseq數(shù)據(jù)集的UMAP聚類

4.植物細(xì)胞類型特異性順式調(diào)節(jié)元件的進(jìn)化

英文標(biāo)題：Evolution of plant cell-type-specific?cis-regulatory elements發(fā)表期刊：bioRxiv

物種樣本：核心物種：水稻（Oryza sativa，C3植物）

比較物種：玉米（Zea mays）、高粱（Sorghum bicolor）、黍（Panicum miliaceum）、Urochloa fusca

測(cè)序策略：單細(xì)胞ATAC測(cè)序、空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（Slide-Seq V2）、Iso-Seq全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

DOI：https://doi.org/10.1101/2024.01.08.574753

發(fā)布時(shí)間：2024.01.08

取樣策略：

單細(xì)胞ATAC測(cè)序：水稻：葉、根、種子、穗等9個(gè)器官；發(fā)育階段：葉原基（P3-P6）、成熟葉（V4階段）；其他物種：玉米、高粱、黍、Browntop Signalgrass

空間轉(zhuǎn)錄組：水稻根

① Cis調(diào)控元件（Cis-regulatory elements, CREs）在基因表達(dá)調(diào)控中至關(guān)重要，但其進(jìn)化機(jī)制的理解仍然具有挑戰(zhàn)性。

② 該研究構(gòu)建了一個(gè)全面的水稻（Oryza sativa）染色質(zhì)可及性單細(xì)胞圖譜，整合了來自103,911個(gè)細(xì)胞核、代表126種離散細(xì)胞狀態(tài)的九個(gè)不同器官的數(shù)據(jù)。通過比較基因組學(xué)，分析了水稻與另外四種禾本科植物（玉米?Zea mays、高粱?Sorghum bicolor、黍?Panicum miliaceum?和?Urochloa fusca）中57,552個(gè)細(xì)胞核的細(xì)胞類型分辨染色質(zhì)可及性之間的差異。

③ 研究發(fā)現(xiàn)，可及染色質(zhì)區(qū)域（Accessible Chromatin Regions, ACRs）的保守性水平因細(xì)胞類型特異性程度的不同而有所區(qū)別。還發(fā)現(xiàn)ACRs、保守的非編碼序列、細(xì)胞類型特異性、保守性和組織特異性切換之間存在復(fù)雜關(guān)系。此外，該研究發(fā)現(xiàn)表皮ACRs相比于其他細(xì)胞類型的ACRs保守性較低，這可能表明這些物種的L1來源的表皮層經(jīng)歷了更快速的調(diào)控進(jìn)化。最后，研究人員鑒定并表征了一組與抑制性組蛋白修飾H3K27me3重疊的保守ACRs，這表明它們可能是由進(jìn)化保留下來的類沉默子CREs。

④ 總體而言，這種比較基因組學(xué)方法揭示了植物細(xì)胞類型特異性CRE進(jìn)化的動(dòng)態(tài)特征。

圖5-利用scATAC-seq數(shù)據(jù)鑒定水稻的細(xì)胞類型和表征ACRs

5.玉米葉原基單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜揭示Kranz解剖結(jié)構(gòu)調(diào)控機(jī)制

英文標(biāo)題：Single-cell?resolved?differentiation?of?pre-Kranz?anatomy?in?maize?leaf?primordia發(fā)表期刊：bioRxiv

物種樣本：玉米（Zea mays?B73）、水稻（Oryza sativa Nipponbare）

測(cè)序策略：單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組、bulk-RNA seq

DOI：https://doi.org/10.1101/2024.07.10.602848

發(fā)布時(shí)間：2024.07.14

取樣策略：

從玉米葉原基：P3-P6原基分段取樣（M3tip、M3middle、M3base；M2top、M2base）、3-4 mm P4原基單細(xì)胞核分離；水稻葉片原基：5 mm原基分段取樣（R3tip、R3middle、R3base）

① 典型的C4植物如玉米，具有高度優(yōu)化的Kranz型葉片結(jié)構(gòu)，其中特定的花環(huán)狀結(jié)構(gòu)由圍繞葉脈緊密排列的葉肉細(xì)胞和維管束鞘細(xì)胞組成。

② 該研究區(qū)分了早期葉原基中維管發(fā)育的活躍區(qū)域，并通過分段的玉米和水稻葉原基的比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，識(shí)別出可能參與早期Kranz發(fā)育的基因群。利用單細(xì)胞核RNA測(cè)序（snRNA-seq），進(jìn)一步探討了單個(gè)玉米葉原基中的細(xì)胞異質(zhì)性和發(fā)育軌跡。借助原位雜交技術(shù)，識(shí)別了mGM和原形成層的細(xì)胞簇，候選標(biāo)記基因顯示出不同但相互關(guān)聯(lián)的表達(dá)模式。維管標(biāo)記基因ZmSHR1的定位先于ZmEREB161和ZmEREB114，這兩者在原形成層的起始階段表達(dá)。

③ 該研究描繪了從發(fā)展中的玉米原基尖端向下的潛在維管束鞘細(xì)胞亞群和不同層次的葉肉細(xì)胞。

④ 綜上所述，該研究識(shí)別出潛在源自mGM或定位于原形成層的Kranz調(diào)控因子，并提供了在亞原基和單細(xì)胞分辨率下研究玉米和水稻葉脈發(fā)育的資源。

圖6-玉米P4葉原基的細(xì)胞異質(zhì)性

6.C4草本植物Kranz解剖結(jié)構(gòu)形成過程中預(yù)存調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重編程

英文標(biāo)題：Comparative spatiotemporal single cell transcriptomes reveal rewiring of pre-existing regulations during emergence of Kranz anatomy in C4?grasses發(fā)表期刊：bioRxiv

物種樣本：玉米（Zea mays）、高粱（Sorghum bicolor）、狗尾草（Setaria viridis）、水稻（Oryza sativa）

測(cè)序策略：單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組、高分辨率空間轉(zhuǎn)錄組

DOI：https://doi.org/10.1101/2024.10.28.620769

發(fā)布時(shí)間：2024.10.28

取樣策略：

單細(xì)胞核&空間轉(zhuǎn)錄組：12日齡玉米幼苗基部莖段葉原基（P3-P6），通過Cellpose 2.0識(shí)別細(xì)胞壁輪廓，提取14,037個(gè)空間單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組

① 世界上許多高產(chǎn)的糧食作物和生物能源作物都采用C4光合作用，這種光合作用通過基于Kranz解剖結(jié)構(gòu)的CO2濃縮機(jī)制實(shí)現(xiàn)了高光合效率。

② 該研究通過比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法，結(jié)合玉米（Zea mays）葉原基的單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，以及三種C4植物（玉米、高粱、狗尾草）和一種C3植物（水稻）對(duì)應(yīng)葉組織的單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）圖譜，研究了Kranz解剖結(jié)構(gòu)發(fā)育和演化過程中涉及的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

③ 研究表明，Kranz解剖結(jié)構(gòu)的形成涉及對(duì)現(xiàn)有調(diào)控模塊的廣泛招募和改造，特別是SHR-SCR模塊和生長(zhǎng)素信號(hào)通路。研究還發(fā)現(xiàn)，INDETERMINATE DOMAIN（IDD）家族轉(zhuǎn)錄因子（如IDD7和IDDP1）在這些模塊的改造中發(fā)揮了重要作用。這種對(duì)現(xiàn)有基因調(diào)控程序的廣泛招募和改造，是C4光合作用在演化過程中反復(fù)出現(xiàn)的基礎(chǔ)機(jī)制。

圖7-玉米葉原基的空間轉(zhuǎn)錄組研究

7.C3-C4中間型十字花科植物維管束鞘細(xì)胞在光呼吸穿梭中的功能

英文標(biāo)題：Single-nuclei sequencing of Moricandia arvensis reveals bundle sheath cell function in the photorespiratory shuttle of?C3-C4?intermediate Brassicaceae發(fā)表期刊：bioRxiv

物種樣本：C3-C4?中間型植物：堇娘芥（Moricandia arvensis）

測(cè)序策略：單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組

DOI：https://doi.org/10.1101/2024.12.02.626447

發(fā)布時(shí)間：2024.12.02

取樣策略：

單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組：取5-6葉期堇娘芥幼苗的第五、第六葉片（距地面5mm處）

公共數(shù)據(jù)：擬南芥葉片單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)

幼年期：0、1、2、3、4周；成年期：6、8、12周；老年期：6月、1年、2年。

① 基因表達(dá)的空間限制決定了細(xì)胞身份，并且是復(fù)雜植物性狀的基礎(chǔ)。在從C3光合作用向更高效的C4光合作用的進(jìn)化過程中，將甘氨酸脫羧酶反應(yīng)限制在維管束鞘細(xì)胞內(nèi)，通過光呼吸甘氨酸穿梭啟動(dòng)了碳濃縮機(jī)制。通常認(rèn)為，這一進(jìn)化步驟在從祖先的C3光合作用向C4光合作用的過渡中起到了重要作用。執(zhí)行這一穿梭機(jī)制的植物通常被稱為C3-C4中間型植物或C2植物。在十字花科（Brassicaceae）家族中，這類植物至少獨(dú)立進(jìn)化了五次。然而，關(guān)于十字花科C3-C4中間型植物的生物化學(xué)研究?jī)H限于少數(shù)關(guān)于葉肉細(xì)胞與維管束鞘細(xì)胞之間差異定位蛋白的案例研究。

② 該研究利用最近在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方面的進(jìn)展，更好地理解新的細(xì)胞特化如何影響相互關(guān)聯(lián)的途徑。研究人員為具有C3-C4中間特征的堇娘芥（Moricandia arvensis）生成了單細(xì)胞核RNA測(cè)序數(shù)據(jù)集，并將其與公開可用的C3擬南芥（Arabidopsis thaliana）葉組織的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了比較，還通過免疫金標(biāo)記技術(shù)結(jié)合電子顯微鏡獨(dú)立驗(yàn)證了選定光呼吸蛋白的定位。

③ 該研究分析揭示了與光呼吸甘氨酸脫羧酶反應(yīng)直接相關(guān)的基因表達(dá)的變化，同時(shí)也包括相關(guān)途徑的基因表達(dá)轉(zhuǎn)移，例如銨的同化、特定氨基酸的合成、氧化還原調(diào)節(jié)和對(duì)M. arvensis維管束鞘的轉(zhuǎn)運(yùn)。相比之下，在C4植物中，這些基因的表達(dá)并未局限于這一細(xì)胞類型。

圖8-堇娘芥葉片單細(xì)胞圖譜

Ps:關(guān)注時(shí)空組學(xué)在植物光合作用研究請(qǐng)聯(lián)系當(dāng)?shù)貥I(yè)務(wù)經(jīng)理獲取原文~

根據(jù)上述文獻(xiàn)，可以總結(jié)出應(yīng)用時(shí)空組學(xué)解析植物光合作用機(jī)制常用思路的技術(shù)路線圖。

參考文獻(xiàn)：

自2023年6月，百創(chuàng)時(shí)空技術(shù)第一篇文章見刊至今19個(gè)月內(nèi)，使用百創(chuàng)時(shí)空技術(shù)文章累計(jì)33篇，在線文章平均影響因子12+，涉及哺乳動(dòng)物（含人鼠）、水生（淡水及海洋）、禽類、兩棲、林木、作物及蔬菜等26個(gè)物種，25個(gè)組織類型，涵蓋腫瘤研究、疾病機(jī)制、再生、進(jìn)化、發(fā)育、綜述建議及技術(shù)算法等領(lǐng)域。

部分文章展示

1.腫瘤研究

中文題目：整合分子和空間分析揭示原位和侵襲性肢端黑色素瘤的進(jìn)化動(dòng)態(tài)和腫瘤免疫相互作用

發(fā)表期刊：Cancer Cell

發(fā)表年份：2024

影響因子：48.8

DOI號(hào)：10.1016/j.jhazmat.2025.137375

文章采用技術(shù)：BMKMANU S1000、WES、Multi-region sequencing、Bulk RNA seq、10X Chromium、CODEX

樣本類型：人原位黑色素瘤（AMis）和侵襲性黑色素瘤（iAM）的腫瘤組織，相鄰正常皮膚，外周血

文章簡(jiǎn)介：

為在空間水平探究 APOE+CD163+ 巨噬細(xì)胞亞群與 EMT 腫瘤細(xì)胞的互相作用，研究人員利用百創(chuàng)S1000空間轉(zhuǎn)錄技術(shù)對(duì)10例 AM 樣本進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)（數(shù)據(jù)中能夠明確區(qū)分表皮的基底層、棘層、顆粒層以及汗腺和血管，腫瘤區(qū)域高表達(dá)黑色素基因MLANA、PMEL、TYPR?和 DCT）。

數(shù)據(jù)表明（與單細(xì)胞數(shù)據(jù)聯(lián)合分析）C3 亞型的 EMT 腫瘤細(xì)胞占比高，并且有 APOE+CD163+ 巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，巨噬細(xì)胞與 EMT 腫瘤細(xì)胞具有共定位特征。CellChat 互作分析驗(yàn)證了 APOE+CD163+ 巨噬細(xì)胞的高度受體配體互作，與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組結(jié)果高度一致（APOE+/CD163+ 巨噬細(xì)胞是空間中 IGF 通路網(wǎng)絡(luò)的發(fā)送者（sender）和影響者（Influencer））。使用空間單細(xì)胞蛋白組學(xué)對(duì)患者腫瘤免疫微環(huán)境進(jìn)行了深入分析，結(jié)果顯示APOE+CD163+ TAM和EMThigh腫瘤細(xì)胞存在高度相關(guān)的定位，這與空間轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果一致。

2.疾病機(jī)制

中文題目：單細(xì)胞RNA測(cè)序研究全氟辛酸誘導(dǎo)的小鼠胚胎著床損傷

發(fā)表期刊：Journal of Hazardous Materials

發(fā)表年份：2025

影響因子：12.2

DOI號(hào)：https://doi.org/10.1073/pnas.2310163120

文章采用技術(shù)：BMKMANU DG1000、Bulk RNA seq、LC-MS/MS

樣本類型：鼠子宮

文章簡(jiǎn)介：

全氟辛酸（PFOA）是一種環(huán)境持久性化學(xué)物質(zhì)，對(duì)人類健康構(gòu)成顯著風(fēng)險(xiǎn)。研究表明PFOA會(huì)影響女性生殖，但其對(duì)子宮內(nèi)膜容受性和潛在機(jī)制的具體影響尚不清楚。

該研究通過小鼠模型，研究了低劑量PFOA暴露對(duì)子宮內(nèi)膜容受性的影響。結(jié)果表明，PFOA暴露顯著損害了子宮內(nèi)膜容受性，導(dǎo)致胚胎著床率顯著下降。利用單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)，研究者全面分析了PFOA破壞子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞功能和發(fā)育的具體機(jī)制。值得注意的是，研究者發(fā)現(xiàn)ANGPTL（血管生成素樣）信號(hào)通路失調(diào)，這一通路對(duì)于子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞之間的通信至關(guān)重要，最終導(dǎo)致胚胎著床失敗。這些發(fā)現(xiàn)為PFOA的生殖毒性提供了新的見解，并強(qiáng)調(diào)了針對(duì)環(huán)境污染物相關(guān)不孕癥治療干預(yù)的潛在靶點(diǎn)。

3.再生研究

中文題目：空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序揭示番茄愈傷組織芽再生的分子機(jī)制

發(fā)表期刊：PNAS

發(fā)表年份：2023

影響因子：10.1

DOI號(hào)：https://doi.org/10.1073/pnas.2310163120

文章采用技術(shù)：BMKMANU S1000、Stereo-seq、10X Visium、10X Chromium

樣本類型：番茄愈傷組織

文章簡(jiǎn)介：

該研究首次揭示了番茄愈傷組織內(nèi)部細(xì)胞的異質(zhì)性，并在單細(xì)胞水平上詳細(xì)解析了激素信號(hào)和重要調(diào)控因子在各種細(xì)胞和組織中的表達(dá)情況。研究結(jié)果不僅發(fā)現(xiàn)了表皮和芽原基細(xì)胞的亞型和功能，還揭示了綠色組織（chlorenchyma）細(xì)胞在芽原基細(xì)胞位置和分化發(fā)展中的重要作用，以及光照如何通過促進(jìn)綠色組織細(xì)胞的發(fā)育和激活雷帕霉素靶蛋白TOR來推動(dòng)芽再生過程。

4.綜述建議

中文題目：系統(tǒng)比較基于測(cè)序的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法

發(fā)表期刊：Nature Methods

發(fā)表年份：2024

影響因子：36.1

DOI號(hào)：?10.1038/s41592-024-02325-3

文章采用技術(shù)：BMKMANU S1000、Stereo-seq、Visium、Slide-seq V2、Salus、DynaSpatial、DBiT-seq、PIXEL-seq、Slide-tag、Curio Seeker、HDST、In situ hybridization

樣本類型：小鼠胚胎（眼球）、成年小鼠大腦（海馬）、小鼠嗅球

文章簡(jiǎn)介：

空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（sST）技術(shù)使得在組織水平上測(cè)量基因表達(dá)的空間分布成為可能。然而，目前對(duì)于不同sST平臺(tái)的系統(tǒng)性比較研究還較為缺乏，技術(shù)之間的差異和數(shù)據(jù)集的多樣性給標(biāo)準(zhǔn)化評(píng)估指標(biāo)的制定帶來了挑戰(zhàn)。

該研究建立了一套具有明確組織學(xué)結(jié)構(gòu)的參考組織和區(qū)域，并利用這些參考組織生成數(shù)據(jù)，比較了11種sST方法。研究發(fā)現(xiàn)，分子擴(kuò)散是不同方法和組織之間的變量參數(shù)，顯著影響有效分辨率。

此外，空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)展示了單細(xì)胞數(shù)據(jù)所不具備的獨(dú)特屬性，例如增強(qiáng)捕獲模式化稀有細(xì)胞狀態(tài)及其特定標(biāo)記物的能力，盡管這種能力受到測(cè)序深度和分辨率等多種因素的影響。該研究為生物學(xué)家選擇sST平臺(tái)提供了指導(dǎo)，有助于促進(jìn)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)的共識(shí)形成，并為未來基準(zhǔn)測(cè)試工作建立框架，可作為開發(fā)和評(píng)估空間轉(zhuǎn)錄組分析計(jì)算工具的黃金標(biāo)準(zhǔn)。

5.發(fā)育研究

中文題目：組織學(xué)和單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組分析揭示玉米莖葉枕發(fā)育中韌皮纖維細(xì)胞的特化功能和調(diào)控葉片角度的關(guān)鍵因子

發(fā)表期刊：Molecular Plant

發(fā)表年份：2024

影響因子：27.5

DOI號(hào)：10.1016/j.molp.2024.05.001

文章采用技術(shù)：BMKMANU DG1000、Bulk RNA seq、Chip-seq、RNA原位雜交、CRISPR/Cas9

樣本類型：玉米莖葉

文章簡(jiǎn)介：

葉片角度（Leaf Angle, LA）是影響玉米種植密度和產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。然而，調(diào)控葉片角度形成的機(jī)制尚不清楚。該研究通過對(duì)不同玉米自交系的莖葉枕區(qū)域進(jìn)行比較組織學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)葉片角度大小顯著受到莖葉枕上表皮韌皮纖維細(xì)胞（SC）的初始伸長(zhǎng)和隨后的木質(zhì)化的影響。通過批量和單細(xì)胞核RNA測(cè)序，生成了莖葉枕區(qū)域的全面轉(zhuǎn)錄組圖譜，并鑒定了許多可能影響其特化為SC的下皮細(xì)胞富集基因。

此外，研究者功能驗(yàn)證了兩個(gè)編碼非典型bHLH轉(zhuǎn)錄因子的基因bHLH30及其同源基因bHLH155，它們?cè)谏扉L(zhǎng)的上表皮細(xì)胞中高表達(dá)。遺傳分析表明，bHLH30和bHLH155正向調(diào)控葉片角度的擴(kuò)張，分子實(shí)驗(yàn)表明它們能夠激活細(xì)胞伸長(zhǎng)和SC木質(zhì)化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。這些發(fā)現(xiàn)突出了莖葉枕上表皮SC在通過限制莖葉枕細(xì)胞的進(jìn)一步延伸和增強(qiáng)機(jī)械強(qiáng)度來調(diào)控葉片角度方面的特化功能。莖葉枕區(qū)域的單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組圖譜不僅加深了研究者對(duì)葉片角度調(diào)控的理解，還為現(xiàn)代玉米育種中優(yōu)化植物結(jié)構(gòu)提供了許多潛在靶點(diǎn)。

6.技術(shù)算法

中文題目：利用基于膜的邊界定義和提高單細(xì)胞分辨率來提高空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)

發(fā)表期刊：Small Methods

發(fā)表年份：2025

影響因子：15.36

DOI號(hào)：?10.1002/smtd.202401056

文章采用技術(shù)：BMKMANU S1000、Stereo-seq、scRNA-seq

樣本類型：小鼠（腦、腸和肝），球墨西哥鈍口螈（腦、腸和肝）

文章簡(jiǎn)介：

準(zhǔn)確界定細(xì)胞邊界是空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（Spatial Transcriptomics, ST）的技術(shù)難題。目前常用的方法是基于細(xì)胞核染色或數(shù)學(xué)推導(dǎo)，這些方法要么排除了細(xì)胞質(zhì)，要么只能確定假設(shè)性的邊界。

該研究提出了一種新的細(xì)胞邊界定義方法：利用基因編碼的熒光蛋白對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行標(biāo)記，從而能夠在組織切片上精確定位細(xì)胞內(nèi)的測(cè)序位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄本。與基于細(xì)胞核的方法相比，這種基于細(xì)胞膜的方法顯著增加了捕獲的基因數(shù)量，小鼠和墨西哥鈍口螈肝臟中基因數(shù)量分別增加了67%和119%。

此外，該方法獲得的表達(dá)譜與單細(xì)胞 RNA 測(cè)序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)更為一致，顯示出更合理的聚類和明顯的細(xì)胞類型特異性標(biāo)記。該方法還提高了單細(xì)胞分辨率，能夠更好地識(shí)別稀有細(xì)胞類型并詳細(xì)解析墨西哥鈍口螈大腦和腸的空間域。除了常規(guī)細(xì)胞外，該方法還能夠準(zhǔn)確識(shí)別小鼠肝臟中的多核細(xì)胞和無核細(xì)胞，展示了其分析復(fù)雜組織和器官的能力，這是以往方法無法實(shí)現(xiàn)的。該研究為改善空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)提供了一種強(qiáng)大的工具，具有廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的潛力。

7.進(jìn)化研究

中文題目：追蹤空氣鳳梨從陸地到空中生態(tài)位的進(jìn)化和遺傳足跡

發(fā)表期刊：Nature Communications

發(fā)表年份：2024

影響因子：14.919

DOI號(hào)：10.1038/s41467-024-53756-7

文章采用技術(shù)：BMKMANU S1000、Stereo-seq、SMART-seq、16S rRNA測(cè)序、全基因組重測(cè)序、基因組組裝

樣本類型：空氣鳳梨亞科植物

文章簡(jiǎn)介：

該研究以鳳梨科的空氣鳳梨亞科為模型植物，探索其起源、進(jìn)化和多樣性。通過基于核轉(zhuǎn)錄組序列的系統(tǒng)發(fā)育樹分析，發(fā)現(xiàn)核心空氣鳳梨起源于約1130萬年前的安第斯山脈。安第斯山脈的地質(zhì)抬升推動(dòng)了空氣鳳梨向儲(chǔ)水型和空氣型的分化?；蚪M和轉(zhuǎn)錄組分析揭示了與儲(chǔ)水型和吸收性毛狀體等適應(yīng)性特征相關(guān)的基因變異和丟失。此外，研究還發(fā)現(xiàn)了空氣鳳梨葉表皮中特定的固氮細(xì)菌群落，可能是其獲取氮素的潛在來源。該研究為理解空氣鳳梨對(duì)空中生態(tài)位的適應(yīng)性進(jìn)化提供了多組學(xué)視角。

在短短19個(gè)月間，百創(chuàng)時(shí)空技術(shù)已在科研領(lǐng)域綻放出耀眼光芒，見刊文章數(shù)量穩(wěn)步增長(zhǎng)，影響因子成績(jī)斐然，研究范圍橫跨多物種與多組織類型，領(lǐng)域覆蓋更是廣泛而深入。這不僅是對(duì)百創(chuàng)時(shí)空技術(shù)先進(jìn)性與實(shí)用性的有力證明，也為眾多科研工作者開辟了新的研究路徑。未來，百創(chuàng)時(shí)空技術(shù)會(huì)持續(xù)創(chuàng)新突破，在更多未知領(lǐng)域開疆拓土，助力科研成果不斷涌現(xiàn)，為推動(dòng)生命科學(xué)進(jìn)步與技術(shù)革新貢獻(xiàn)更為強(qiáng)大的力量！?

文章標(biāo)題：Spatiotemporal dynamics of early oogenesis in pigs

期刊名稱：Genome Biology

影響因子：10.1

合作單位：青島農(nóng)業(yè)大學(xué)

發(fā)表日期：2025.01.02

研究方法：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組（10x Chromium）、空間轉(zhuǎn)錄組（10x Visium）、高分辨率空間轉(zhuǎn)錄組（BMKMANU S1000）、免疫熒光

百邁客生物為該研究中的E65胚胎卵巢提供了BMKMANU S1000空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)服務(wù)。

研究背景

在發(fā)育中的哺乳動(dòng)物卵巢中，卵泡的位置對(duì)其生物學(xué)功能具有重要影響。休眠卵泡主要位于卵巢皮質(zhì)外部，對(duì)雌性生育周期長(zhǎng)短具有重要影響，而生長(zhǎng)卵泡則位于髓質(zhì)區(qū)域，對(duì)雌性生育的起始至關(guān)重要。然而，目前對(duì)胚胎階段卵巢微環(huán)境形成機(jī)制的理解尚不深入，這主要是由于該過程發(fā)生在胚胎期，涉及多種異質(zhì)細(xì)胞類型的協(xié)同作用。

在小鼠中，原始生殖細(xì)胞從外胚層遷移到生殖脊并在性腺中增殖，隨后在特定時(shí)間點(diǎn)沿前后軸異步啟動(dòng)減數(shù)分裂。最近的研究顯示，這一過程與經(jīng)典的維甲酸信號(hào)無關(guān)，而是通過TEX14形成細(xì)胞間橋來實(shí)現(xiàn)。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了生殖細(xì)胞微環(huán)境在決定其發(fā)育命運(yùn)中的關(guān)鍵作用。

目前對(duì)卵巢發(fā)育中卵母細(xì)胞的研究主要集中在基因表達(dá)上，但對(duì)卵母細(xì)胞在卵泡發(fā)生過程中的細(xì)微空間定位及主要體細(xì)胞類型的空間動(dòng)力學(xué)特征了解有限。通過空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)，該研究揭示了豬早期卵巢發(fā)育中的皮質(zhì)-髓質(zhì)梯度，并發(fā)現(xiàn)人豬之間卵母細(xì)胞空間定位的保守性，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了卵巢微環(huán)境在決定卵母細(xì)胞命運(yùn)中的重要作用。

材料方法

研究材料：通過人工授精培育妊娠豬（三元雜交：Landrace、Large White和Duroc），分別在受精后45、55、65和75天采集胚胎階段的豬卵巢樣本。

研究方法：scRNA-seq（E45、E55、E65、E75胚胎卵巢，共計(jì)18,956個(gè)高質(zhì)量細(xì)胞，10x Genomics Chromium）；空間轉(zhuǎn)錄組（E45、E55、E65、E75胚胎卵巢，10x Visium；E65胚胎卵巢，BMKMANU S1000）

分析方法：空間轉(zhuǎn)錄組解卷積（Cell2location）；RNA速度分析（Velocyto和scVelo）；單細(xì)胞軌跡推斷（Cellrank）；同源基因轉(zhuǎn)化（biomaRt）；細(xì)胞通訊分析（CellphoneDB、biomaRt、ktplots）；蛋白互作分析；GO富集分析；基因模塊分析（Hotspot）

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：免疫熒光；圖像分析和定量分析；Western blotting；卵巢組織體外培養(yǎng)

研究結(jié)果

1.豬早期卵子發(fā)生的單細(xì)胞圖譜的構(gòu)建

為了深入揭示豬卵巢早期卵子發(fā)生的時(shí)空發(fā)育特征，研究者將單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）與10× Visium空間轉(zhuǎn)錄組（ST）技術(shù)相結(jié)合，對(duì)豬卵巢發(fā)育過程中的細(xì)胞空間屬性進(jìn)行了系統(tǒng)分析。4個(gè)發(fā)育時(shí)間點(diǎn)（E45、E55、E65和E75；scRNA-seq各包括2個(gè)胚胎；ST：E45、E55、E65各包括2個(gè)胚胎，E75，1個(gè)胚胎），其中包括早期卵子發(fā)生的各階段。保留了18,956個(gè)高質(zhì)量細(xì)胞，共鑒定出17個(gè)聚類，包含9種主要細(xì)胞類型：生殖細(xì)胞、雙潛能前顆粒細(xì)胞、上皮前顆粒細(xì)胞、性腺間質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管周圍細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞。

圖1-發(fā)育中的豬卵巢的scRNA-seq

2.豬卵巢空間轉(zhuǎn)錄組的細(xì)胞類型解卷積

為了揭示卵巢發(fā)育過程中不同細(xì)胞類型的空間動(dòng)態(tài)變化，研究者進(jìn)行了細(xì)胞類型的解卷積分析。盡管scRNA-seq技術(shù)為剖析復(fù)雜組織中的細(xì)胞異質(zhì)性提供了有力工具，但它缺乏細(xì)胞的空間位置信息。因此，研究者采用10× Visium空間轉(zhuǎn)錄組（ST）技術(shù)進(jìn)行測(cè)序，以更好地展現(xiàn)豬卵巢發(fā)育過程中不同細(xì)胞類型的空間動(dòng)態(tài)變化。研究者首先對(duì)ST數(shù)據(jù)進(jìn)行了質(zhì)量評(píng)估，確保數(shù)據(jù)質(zhì)量符合分析要求。隨后，利用scRNA-seq數(shù)據(jù)作為參考，通過Cell2location算法對(duì)ST數(shù)據(jù)進(jìn)行了細(xì)胞類型的解卷積，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞類型的高分辨率定位。

通過解卷積分析，研究者發(fā)現(xiàn)在E45和E55階段，細(xì)胞類型的空間分布相對(duì)較為“隨機(jī)”。然而，隨著發(fā)育進(jìn)展到E65階段，研究者觀察到了一個(gè)明顯的空間分布模式：生殖細(xì)胞在E45-E55階段隨機(jī)分布在豬卵巢中，而在E65-E75階段則主要定位于皮層區(qū)域，僅有少量位于髓質(zhì)區(qū)域。對(duì)于前顆粒細(xì)胞群，我們觀察到了兩種具有不同空間定位模式的細(xì)胞類型：BPG細(xì)胞在E55之前隨機(jī)分布，并逐漸在E75時(shí)集中于髓質(zhì)區(qū)域；而EPG細(xì)胞則在整個(gè)發(fā)育過程中始終位于卵巢表面。

為進(jìn)一步驗(yàn)證分析結(jié)果，研究者進(jìn)行了全組織染色實(shí)驗(yàn)，使用生殖細(xì)胞標(biāo)志物DDX4和前顆粒細(xì)胞標(biāo)志物KRT19對(duì)E45至E75的胎兒卵巢進(jìn)行染色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與ST數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致。此外，研究者還分析了這些陽(yáng)性細(xì)胞在卵巢背腹軸上的空間分布，并通過熒光強(qiáng)度分析確認(rèn)了生殖細(xì)胞和前顆粒細(xì)胞在皮層和髓質(zhì)區(qū)域的不同分布模式。這些發(fā)現(xiàn)為深入理解豬卵巢發(fā)育過程中細(xì)胞類型的空間動(dòng)態(tài)變化提供了重要線索。

圖2-基于scRNA-seq數(shù)據(jù)使用Cell2location的ST的解卷積

3.空間尺度解析精細(xì)尺度豬生殖細(xì)胞發(fā)育軌跡

為了深入理解生殖細(xì)胞在空間環(huán)境中的發(fā)育過程，研究者提取了生殖細(xì)胞進(jìn)行重新聚類。通過對(duì)生殖細(xì)胞群的精細(xì)分析，研究者發(fā)現(xiàn)了五個(gè)對(duì)應(yīng)的細(xì)胞簇，分別是有絲分裂生殖細(xì)胞（FGC_mitotic）、表達(dá)MECOM和ATM的前減數(shù)生殖細(xì)胞（Oogonia_STRA8）、表達(dá)SYCP1和DMC1的減數(shù)分裂生殖細(xì)胞（Oogonia_meiotic）、表達(dá)FIGLA和NANOS1的早期卵母細(xì)胞（Pre_oocyte）以及表達(dá)ZP4和ZP3的卵母細(xì)胞（Oocyte）。

為了深入了解早期豬卵母細(xì)胞生成過程中模塊基因的功能富集情況，研究人員采用Hotspot算法，利用生殖細(xì)胞的scRNA-seq數(shù)據(jù)識(shí)別了相關(guān)基因模塊，共鑒定出11個(gè)功能各異的基因模塊。通過將單個(gè)模塊投影到UMAP圖中，確定了具有簇特異性的信息性基因模塊。剖析了早期豬卵母細(xì)胞生成過程中的基因表達(dá)譜后，研究人員進(jìn)一步在空間環(huán)境中研究了這一過程。通過對(duì)ST芯片上的生殖細(xì)胞進(jìn)行解卷積，揭示了早期卵母細(xì)胞生成的皮質(zhì)-髓質(zhì)梯度。為了驗(yàn)證上述分析，研究人員使用生殖細(xì)胞標(biāo)記DDX4和減數(shù)分裂生殖細(xì)胞細(xì)線期標(biāo)記γH2AX進(jìn)行了全組織染色實(shí)驗(yàn)，以定位在不同階段啟動(dòng)減數(shù)程序的生殖細(xì)胞。評(píng)估了C-M軸的熒光強(qiáng)度后發(fā)現(xiàn)在E45和E55卵巢中，γH2AX信號(hào)沿C-M軸的水平相似，而在E65至E75卵巢中，γH2AX信號(hào)在內(nèi)皮層達(dá)到峰值，在髓質(zhì)區(qū)域則減少。

圖3-使用空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)（ST）對(duì)生殖細(xì)胞空間位置模式的特征化

為了進(jìn)一步驗(yàn)證分析，研究人員還在同一E65卵巢組織上使用了更高分辨率（BMKMANU S1000；Spot點(diǎn)大小約為10微米）的平臺(tái)進(jìn)行了ST測(cè)序。結(jié)果與E65時(shí)的Visium ST解卷積一致，使用S1000平臺(tái)在E65時(shí)可視化ZP3陽(yáng)性卵母細(xì)胞的空間位置也證實(shí)了其在內(nèi)皮層的表達(dá)。

圖4-生殖細(xì)胞異質(zhì)性及空間位置模式的特征描述

綜上所述，研究人員成功地在單細(xì)胞分辨率下再現(xiàn)了豬生殖細(xì)胞的發(fā)育過程，并闡明了豬卵巢組織中生殖細(xì)胞的空間分布模式。

4.跨物種分析揭示了豬與人類之間生殖細(xì)胞基因表達(dá)程序及空間位置模式的保守性

為了深入理解哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞生成的空間調(diào)控機(jī)制，研究人員進(jìn)行了跨物種分析。研究團(tuán)隊(duì)首先獲取了妊娠后19周人類卵巢的空間轉(zhuǎn)錄組（ST）數(shù)據(jù)，并將其與豬E65時(shí)期的ST數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較，以分析卵母細(xì)胞生成各階段生殖細(xì)胞的空間位置模式。與人類情況一致的是，生殖細(xì)胞標(biāo)記DDX4與5mC和5hmC的共染色顯示，在E55和E75豬卵巢中，5mC和5hmC信號(hào)在DDX4陽(yáng)性細(xì)胞中不可檢測(cè)，且主要在周圍性腺體細(xì)胞中表達(dá)。這些結(jié)果進(jìn)一步揭示，除了保守的基因表達(dá)程序外，人類和豬在早期卵母細(xì)胞生成過程中的表觀遺傳重編程模式也是保守的。

為了研究豬和人類早期卵母細(xì)胞生成過程中皮質(zhì)-髓質(zhì)梯度是否保守，研究人員基于ST數(shù)據(jù)探索了卵母細(xì)胞生成各階段生殖細(xì)胞的空間位置模式。對(duì)于早期卵母細(xì)胞階段的生殖細(xì)胞，這些細(xì)胞在卵巢內(nèi)皮質(zhì)區(qū)域有清晰定位，而在人類中，這些細(xì)胞主要位于內(nèi)皮質(zhì)和外髓質(zhì)區(qū)域，且在內(nèi)皮質(zhì)區(qū)域豐度更高。到了卵母細(xì)胞階段，豬和人類中這些生殖細(xì)胞的位置模式相似，主要位于外髓質(zhì)區(qū)域。通過評(píng)估生殖細(xì)胞到卵巢表面的相對(duì)距離（以卵巢寬度標(biāo)準(zhǔn)化），觀察到豬和人類早期卵母細(xì)胞生成過程均顯示出生殖細(xì)胞的皮質(zhì)-髓質(zhì)梯度定位。這些數(shù)據(jù)不僅揭示了豬和人類早期卵母細(xì)胞生成過程中保守的基因表達(dá)程序和表觀遺傳重編程模式，還強(qiáng)調(diào)了兩種物種在整個(gè)早期卵母細(xì)胞生成階段空間動(dòng)態(tài)的保守性。

圖5-豬與人卵巢ST數(shù)據(jù)的跨物種比較分析

5.基于空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（ST）技術(shù)解析豬卵巢發(fā)育過程中兩種顆粒細(xì)胞譜系的時(shí)空特性

在發(fā)育中的卵巢中，顆粒細(xì)胞與生殖細(xì)胞相互作用，形成了卵巢的基本功能單位，即卵泡。因此，研究人員接下來提取了顆粒細(xì)胞譜系，并使用UMAP進(jìn)行了細(xì)胞聚類分析，共鑒定出10個(gè)細(xì)胞簇。分析了潛在時(shí)間基因表達(dá)動(dòng)態(tài)和顆粒細(xì)胞前體發(fā)育軌跡中wave II型顆粒細(xì)胞（PreGC_II）的命運(yùn)決定。與PreGC_I相比，簇6和7中的基因在PreGC_II命運(yùn)決定中起關(guān)鍵作用，如WNT6、GREM1和SFRP4，這些結(jié)果共同強(qiáng)調(diào)了WNT信號(hào)分子在豬顆粒細(xì)胞前體命運(yùn)決定中的保守作用。此外，ALDH1A2的上調(diào)表明，醛脫氫酶家族成員1A2可能在wave II顆粒細(xì)胞發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

使用空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（ST）技術(shù)對(duì)wave I型顆粒細(xì)胞前體（PreGC_I）和wave II型顆粒細(xì)胞前體（PreGC_II）的標(biāo)志性基因進(jìn)行了空間定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LHX9（PreGC_I的標(biāo)志）和GREM1（PreGC_II的標(biāo)志）的信號(hào)從E45到E75在卵巢中呈現(xiàn)特定的空間分布模式。在E65和E75，GREM1的信號(hào)明顯環(huán)繞著DDX4（生殖細(xì)胞的標(biāo)志）的信號(hào)，表明卵巢卵泡組裝的早期階段，wave II型顆粒細(xì)胞（來源于皮質(zhì)區(qū)域的顆粒細(xì)胞前體）在卵巢卵泡組裝過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

接下來，研究人員分析了顆粒細(xì)胞譜系的空間特性，進(jìn)行了細(xì)胞類型反卷積，并觀察到卵巢表面上皮（OSE）細(xì)胞群主要位于豬卵巢的表面，并隨著發(fā)育的進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量增加。在E45時(shí)，I型顆粒細(xì)胞前體（PreGC_I）細(xì)胞廣泛分布在髓質(zhì)中，部分位于皮質(zhì)中；在E65時(shí)，觀察到I型顆粒細(xì)胞前體（PreGC_I）和II型顆粒細(xì)胞前體（PreGC_II）分別呈現(xiàn)出特定的皮質(zhì)和髓質(zhì)分布模式。通過免疫熒光分析進(jìn)一步驗(yàn)證了這些發(fā)現(xiàn)，上述結(jié)果共同揭示了豬卵巢發(fā)育過程中顆粒細(xì)胞譜系的空間時(shí)間特性。

圖6-使用ST技術(shù)表征前顆粒細(xì)胞的發(fā)育軌跡及其空間定位模式

6.豬卵巢發(fā)育期間主要體細(xì)胞類型的空間特性

除了生殖細(xì)胞和顆粒細(xì)胞外，研究人員還進(jìn)一步以更高分辨率分析了GI（間質(zhì)細(xì)胞）和Sm（平滑肌細(xì)胞）這兩種體細(xì)胞在豬卵巢中的空間分布模式，因?yàn)檫@兩種細(xì)胞類型在豬卵巢中顯示出特征性分布，表明它們可能在塑造卵巢微環(huán)境方面發(fā)揮作用，這對(duì)早期卵子發(fā)生至關(guān)重要。

將GI和Sm的標(biāo)記基因整合到空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)中，觀察到這些體細(xì)胞的空間位置隨著從E45到E75的發(fā)育進(jìn)展而發(fā)生變化。通過RNA速度分析確定的分化譜系細(xì)胞和增殖狀態(tài)細(xì)胞在E45和E55時(shí)的卵巢中隨機(jī)分布，而在E65時(shí)，觀察到這些細(xì)胞在卵巢皮質(zhì)中呈現(xiàn)出明顯的空間聚集模式，特別是在生殖細(xì)胞附近。這些發(fā)現(xiàn)共同揭示了豬卵巢發(fā)育早期體細(xì)胞空間位置模式的動(dòng)態(tài)變化，表明它們?cè)谛纬蓪?duì)早期卵子發(fā)生至關(guān)重要的卵巢微環(huán)境中發(fā)揮潛在作用。

圖7-利用空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（ST）表征類固醇生成細(xì)胞譜系的異質(zhì)性和空間位置模式

7.空間共定位分析揭示了皮質(zhì)區(qū)和髓質(zhì)區(qū)存在截然不同的微環(huán)境，強(qiáng)調(diào)了其在調(diào)控生殖細(xì)胞命運(yùn)中的關(guān)鍵作用

在闡明了發(fā)育中的豬卵巢中主要細(xì)胞類型的時(shí)空特征后，研究人員接下來研究了空間微環(huán)境的變化如何影響發(fā)育中卵巢的細(xì)胞命運(yùn)決定。首先對(duì)細(xì)胞類型豐度進(jìn)行了非負(fù)矩陣分解（NMF），以研究發(fā)育中卵巢中細(xì)胞的空間共定位。NMF分解的應(yīng)用成功地表征了位于皮質(zhì)和髓質(zhì)的生殖細(xì)胞niche，并揭示了與不同空間來源的生殖細(xì)胞共定位的體細(xì)胞。為了全面理解細(xì)胞-細(xì)胞通信模式的功能性，研究人員使用CellphoneDB進(jìn)行GO富集分析，識(shí)別了不同區(qū)域生殖細(xì)胞與體細(xì)胞之間的配體-受體（L-R）對(duì)，發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)和髓質(zhì)區(qū)域之間細(xì)胞-細(xì)胞通信模式的功能富集結(jié)果不同。

此外，研究人員觀察到皮質(zhì)區(qū)域的L-R對(duì)顯著富集了NOTCH信號(hào)通路，PreGC_ii0和PreGC_ii8表達(dá)NOTCH信號(hào)介導(dǎo)因子NOTCH2，而其配體DLK1和JAG1則在向減數(shù)分裂進(jìn)程中的生殖細(xì)胞中表達(dá)，結(jié)果表明NOTCH2在豬早期生殖細(xì)胞命運(yùn)決定中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在髓質(zhì)區(qū)域細(xì)胞-細(xì)胞通信分析揭示了在卵細(xì)胞階段的生殖細(xì)胞表達(dá)了參與原始卵泡組裝的配體，包括BMP4和BDNF，而它們相應(yīng)的受體，包括BMPR1A、BMPR1B和SORT1，則由PreGC i4和PreGC i7表達(dá)。研究人員發(fā)現(xiàn)髓質(zhì)區(qū)域的體細(xì)胞表達(dá)了一系列細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白，而皮質(zhì)區(qū)域則不是這樣，表明ECM蛋白在調(diào)節(jié)豬卵母細(xì)胞生成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞通訊分析，研究人員接下來探討了在使用從E55卵巢皮質(zhì)和髓質(zhì)中分離的卵巢組織進(jìn)行體外條件下，補(bǔ)充NOTCH信號(hào)抑制劑DAPT和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑多西環(huán)素是否會(huì)影響生殖細(xì)胞命運(yùn)。從E55胎兒卵巢中解剖出皮質(zhì)和髓質(zhì)組織，將這些組織進(jìn)行體外培養(yǎng)，并在用DAPT處理10天后觀察到皮質(zhì)卵巢組織中減數(shù)分裂標(biāo)志物STRA8的表達(dá)水平顯著降低，而髓質(zhì)卵巢組織則沒有這種情況。相反，在用基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑多西環(huán)素處理10天后，觀察到卵泡形成標(biāo)志物L(fēng)HX8的表達(dá)水平降低，而在皮質(zhì)組織中未觀察到可比的影響。綜上所述，這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持了在空間背景下的細(xì)胞-細(xì)胞通訊分析，并強(qiáng)調(diào)了卵巢微環(huán)境在調(diào)節(jié)生殖細(xì)胞命運(yùn)中的重要作用。

圖8-卵巢皮質(zhì)和髓質(zhì)之間細(xì)胞-細(xì)胞通訊模式的比較

研究總結(jié)

綜上所述，該研究基于單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，深入探討了豬早期卵子發(fā)生過程中的時(shí)空基因表達(dá)譜和卵巢微環(huán)境的空間組織，以及這些特征在人類中的保守性。這些發(fā)現(xiàn)不僅豐富了我們對(duì)豬繁殖性狀形成復(fù)雜機(jī)制的認(rèn)識(shí)，還為生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究提供了新的視角和方法。

2025年才過去幾天，百創(chuàng)S系列空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)迎來開門紅！本期我們盤點(diǎn)了6篇2025年應(yīng)用百創(chuàng)S系列空間技術(shù)發(fā)表的時(shí)空組學(xué)文章，這些成果發(fā)表期刊有Journal for ImmunoTherapy of Cancer(IF=10.3)、Genome Biology(IF=10.1)、Industrial Crops and Products、BMC Genomics以及預(yù)印本系統(tǒng)bioRxiv。研究的物種涉及人、豬、鱖魚、玉米、蘆葦、榛子等，涉及組織部位主要是腎腫瘤、胚胎卵巢、幽門盲腸、雌穗、雄穗、莖芽、胚珠等。接下來，我們一起來看看2025最新的時(shí)空組學(xué)文章吧！

一、人腎透明細(xì)胞癌時(shí)空?qǐng)D譜

英文標(biāo)題：Spatial and single-cell transcriptomics reveal cellular heterogeneity and a novel cancer-promoting Treg cell subset in human clear-cell renal cell carcinoma

發(fā)表期刊：Journal for ImmunoTherapy of Cancer

影響因子：10.3

病例樣本：腎透明細(xì)胞癌患者

測(cè)序策略：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、空間轉(zhuǎn)錄組（BMKMANU S1000細(xì)胞分割）

DOI：10.1136/jitc-2024-010183

發(fā)布時(shí)間：2025.01.04

百邁客生物為該研究提供了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和百創(chuàng)S1000空間轉(zhuǎn)錄組（細(xì)胞分割）技術(shù)服務(wù)。

取樣策略：

單細(xì)胞&空間轉(zhuǎn)錄組(細(xì)胞分割)：腎透明細(xì)胞癌患者手術(shù)切除腎腫瘤組織（n=4，P1-P4）

流式細(xì)胞術(shù)、組織化學(xué)染色：腎透明細(xì)胞癌患者PBMC和手術(shù)切除腎腫瘤組織（n=15）

① 透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌（ccRCC）是腎細(xì)胞癌（RCC）中最常見的組織學(xué)類型。然而，免疫抑制細(xì)胞的空間和功能異質(zhì)性以及它們相互作用促進(jìn)透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中免疫抑制的機(jī)制尚未得到深入研究。

② 在該研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)了之前未報(bào)道過的間質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞亞群，并以更高的分辨率繪制了它們的空間位置圖。此外，根據(jù)六個(gè)特征性基因集（包括上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化高表達(dá)細(xì)胞群、轉(zhuǎn)移細(xì)胞群和近端小管高表達(dá)細(xì)胞群）去除了批次效應(yīng)后，驗(yàn)證了腫瘤細(xì)胞群。

③ 重要的是，該研究鑒定出一種特殊的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）亞群，該亞群具有終末效應(yīng)Treg細(xì)胞的分子特征，但表達(dá)多種細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素（IL）-1β和IL-18。這組Treg細(xì)胞具有更強(qiáng)的免疫抑制功能，且與透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌（ccRCC）隊(duì)列的不良預(yù)后相關(guān)。它們?cè)谀[瘤-正常組織交界處與MRC1+FOLR2+腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）共定位，形成一個(gè)正反饋循環(huán)，維持協(xié)同的致癌作用。此外，研究人員追蹤了IL-1β+Treg細(xì)胞的起源，并揭示IL-18可通過ERK/NF-κB途徑誘導(dǎo)Treg細(xì)胞中IL-1β的表達(dá)。

圖1-腎透明細(xì)胞癌（ccRCC）細(xì)胞群的整體分析

二、豬早期卵子發(fā)生的時(shí)空?qǐng)D譜

英文標(biāo)題：Spatiotemporal dynamics of early oogenesis in pigs

發(fā)表期刊：Genome Biology

影響因子：10.1

物種樣本：豬

測(cè)序策略：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、空間轉(zhuǎn)錄組（10x Visium、BMKMANU S1000）

DOI：10.1186/s13059-024-03464-8

發(fā)布時(shí)間：2025.01.02

百邁客生物為該研究提供了百創(chuàng)S1000空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)服務(wù)。

取樣策略：

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組：豬E45、E55、E65、E75胚胎卵巢（n=2）

空間轉(zhuǎn)錄組：豬E45、E55、E65、E75胚胎卵巢，10x Visium；E65胚胎卵巢，BMKMANU S1000

① 該研究結(jié)合單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)(ST)來理解時(shí)空基因表達(dá)譜，并探索在豬卵子發(fā)生早期卵巢微環(huán)境的空間組織。將卵子發(fā)生不同階段的生殖細(xì)胞簇投射到空間圖譜中，揭示了發(fā)育中的豬卵巢中生殖細(xì)胞的“皮質(zhì)-髓質(zhì)(C-M)”分布。豬和人之間的跨物種分析揭示了在卵子發(fā)生過程中生殖細(xì)胞的保守的C-M分布模式，突出了豬可以作為人類早期卵子發(fā)生過程的理想模型。

② 利用ST進(jìn)行RNA速度分析，確定了豬卵巢皮質(zhì)和髓質(zhì)區(qū)顆粒細(xì)胞系的分子特征和空間動(dòng)力學(xué)?？臻g共定位分析和細(xì)胞間通訊分析揭示了皮質(zhì)和髓質(zhì)區(qū)域生殖細(xì)胞和體細(xì)胞之間獨(dú)特的細(xì)胞-細(xì)胞通訊模式。

③ 值得注意的是，卵巢組織的體外培養(yǎng)證實(shí)細(xì)胞間NOTCH信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞外間質(zhì)(ECM)蛋白在啟動(dòng)減數(shù)分裂和卵子形成程序中起關(guān)鍵作用，突出了卵巢微環(huán)境對(duì)于生殖細(xì)胞的命運(yùn)調(diào)控起著重要作用。

圖2-基于scRNA-seq數(shù)據(jù)使用Cell2location的ST的解卷積

圖3-利用S1000平臺(tái)對(duì)ZP3在E65階段的表達(dá)豐度進(jìn)行精細(xì)可視化分析

三、榛子胚珠時(shí)空?qǐng)D譜

英文標(biāo)題：Obstacles in sugar transportation lead to blank nut formation in hazel (Corylus heterophylla)

發(fā)表期刊：Industrial Crops & Products

影響因子：5.6

物種樣本：榛子

測(cè)序策略：空間轉(zhuǎn)錄組(BMKMANU S1000)

DOI：doi.org/10.1016/j.indcrop.2024.120365

發(fā)布時(shí)間：2025.01.04

百邁客生物為該研究提供了百創(chuàng)S1000空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)服務(wù)。

取樣策略：

百創(chuàng)S1000空間轉(zhuǎn)錄組：兩個(gè)野生型榛子，包括一個(gè)大的、發(fā)育中的胚珠（WTL）和一個(gè)小的、敗育胚珠（WTs），以及一個(gè)從空殼榛子種質(zhì)中分離出來的敗育胚珠。

① 這篇文章研究了榛子栽培中導(dǎo)致產(chǎn)量損失的空殼果形成的潛在分子機(jī)制。向結(jié)正常果的野生型榛子和結(jié)空殼果的空殼果種質(zhì)（BNG）植株的葉片中引入13C，并比較了這兩種類型植株葉片和果實(shí)中的13C豐度。光合作用的13C標(biāo)記產(chǎn)物被迅速運(yùn)輸?shù)桨凸麑?shí)中，胚珠中的δ13C值高于苞片、外殼和薄壁組織。

② 對(duì)正常發(fā)育和敗育胚珠進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，鑒定出可能與胚珠敗育相關(guān)的基因。在BNG中，葉片中合成的光合13C產(chǎn)物積累并緩慢向外運(yùn)輸。BNG的外殼、薄壁組織和胚珠中的δ13C值明顯低于對(duì)照組，僅占對(duì)照組的1.3%~18.7%。根據(jù)每個(gè)Spots點(diǎn)基因表達(dá)的相似性，研究人員獲得了六個(gè)簇，包括476個(gè)不同空間區(qū)域的獨(dú)特差異表達(dá)基因（DEGs）。在這些DEG簇中，只有cluster3的DEG在碳水化合物代謝和運(yùn)輸相關(guān)的生物過程中顯著富集，其中蔗糖合酶（SUS，Cor0134990.1）在這些與碳水化合物代謝相關(guān)的DEG中表達(dá)豐度最高。

③ 根據(jù)序列比對(duì)結(jié)果的相似性，研究人員在擬南芥中鑒定了四個(gè)SUS（Cor0134990.1）突變體，它們的種子大小明顯小于野生型。除了SUS外，研究人員還鑒定了一些可能調(diào)節(jié)榛子胚珠發(fā)育的重要基因，為揭示空殼榛子的形成機(jī)制提供了新見解。

圖4-高變基因的選擇和Spots聚類

四、全基因組復(fù)制在玉米花發(fā)育進(jìn)化中的時(shí)空?qǐng)D譜

英文標(biāo)題：Cross-species single-nucleus analysis reveals the potential role of whole-genome duplication in the evolution of maize flower development

發(fā)表期刊：BMC Genomics

影響因子：3.5

物種樣本：玉米、高粱

測(cè)序策略：單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組、空間轉(zhuǎn)錄組(BMKMANU S1000)

DOI：10.1186/s12864-024-11186-1

發(fā)布時(shí)間：2025.01.03

百邁客生物為該研究提供了百創(chuàng)S1000空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)服務(wù)。

取樣策略：

單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組&空間轉(zhuǎn)錄組：玉米雌穗、雄穗、高粱花序組織

① 在該研究中，研究人員為玉米雌穗、雄穗和高粱花序生成了單細(xì)胞核和空間RNA-seq數(shù)據(jù)。通過結(jié)合單細(xì)胞核和空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，研究人員可以追蹤單細(xì)胞核簇標(biāo)記基因的空間表達(dá)，并將單細(xì)胞核簇映射到空間位置上。這種能力為注釋單細(xì)胞核簇提供了強(qiáng)大的支持。

② 將細(xì)胞簇解析的轉(zhuǎn)錄組比較與基因組比對(duì)相結(jié)合，該研究分析表明，玉米雌穗和雄穗花序的多樣性與玉米特有的全基因組復(fù)制事件相關(guān)。以高粱作為外類群，很可能是基因表達(dá)譜的丟失導(dǎo)致了雄穗和雌穗之間的花序多樣性，從而形成了玉米的單性花結(jié)構(gòu)。此外，雄穗中高表達(dá)基因的序列比雌穗中高表達(dá)基因的序列更為保守。

圖5-基于空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和標(biāo)記基因的玉米雌穗和雄穗的細(xì)胞聚類與細(xì)胞類型鑒定

五、時(shí)空?qǐng)D譜揭示了B染色體在驅(qū)動(dòng)植物入侵中的作用

英文標(biāo)題：Single-cell and spatial transcriptomics uncover the role of B chromosomes in driving plant invasiveness

發(fā)表期刊：bioRxiv

物種樣本：蘆葦

測(cè)序策略：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、空間轉(zhuǎn)錄組(BMKMANU S3000)

DOI：https://doi.org/10.1101/2024.12.31.630906

發(fā)布時(shí)間：2025.01.01

百邁客生物為該研究提供了百創(chuàng)S3000空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)服務(wù)。

取樣策略：

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組：非入侵蘆葦組由根狀莖再生的新形成的芽組織EU 60、EU 78、EU 620；入侵蘆葦組由根狀莖再生的新形成的芽組織NAi nt61、NAi nt113、NAi nt191（每組有3個(gè)生物學(xué)重復(fù)）

空間轉(zhuǎn)錄組：入侵蘆葦組由根狀莖再生的新形成的芽組織NAi nt61（n=2，兩個(gè)重復(fù)包埋在一起）

① 入侵植物能嚴(yán)重破壞本土生物多樣性，但其成功入侵背后的遺傳機(jī)制仍不甚明了。迄今為止，僅對(duì)少數(shù)入侵物種進(jìn)行了基因組學(xué)研究，且尚未應(yīng)用單細(xì)胞水平的研究。

② 該研究探討了普通蘆葦（Phragmites australis）入侵行為的遺傳驅(qū)動(dòng)因素，這是一種原產(chǎn)于歐洲、后被引入北美并成為入侵物種的耐寒草類。通過整合全基因組測(cè)序、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，研究人員構(gòu)建了普通蘆葦莖系統(tǒng)的綜合單細(xì)胞圖譜。UMAP分析在莖系統(tǒng)中鑒定出19個(gè)獨(dú)特的細(xì)胞簇?；虮倔w（GO）富集分析實(shí)現(xiàn)了對(duì)關(guān)鍵細(xì)胞類型的注釋，包括葉肉細(xì)胞、表皮細(xì)胞、維管束鞘細(xì)胞和木質(zhì)部細(xì)胞，以及莖尖分生組織和側(cè)生分生組織、腋生分生組織。RNA速度分析揭示了葉肉細(xì)胞的多能性，其中第3簇的葉綠組織細(xì)胞被確定為能夠分化為各種組織的祖細(xì)胞，而第1簇則向通氣組織發(fā)育。

③ 歐洲種群與北美入侵種群之間的比較分析顯示，轉(zhuǎn)錄活性和基因表達(dá)存在顯著差異，尤其是在與莖尖分生組織相關(guān)的細(xì)胞簇中。入侵種群中B染色體的出現(xiàn)頻率更高，且IMPA-3、SSC3和DDE家族核酸內(nèi)切酶基因在近所有細(xì)胞簇中均顯著上調(diào)，尤其是在葉肉細(xì)胞和分生組織區(qū)域附近。作為抗性（R）基因主要受體的IMPA-3的快速突變可能增強(qiáng)了北美入侵種群的適應(yīng)性。這些發(fā)現(xiàn)為理解普通蘆葦入侵性的細(xì)胞發(fā)育和基因組多樣性提供了關(guān)鍵見解，并為制定生態(tài)管理策略提供了寶貴信息。

圖6-對(duì)普通蘆葦芽的組織進(jìn)行單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

六、鱖魚感染蛙虹彩病毒后幽門盲囊的時(shí)空?qǐng)D譜

英文標(biāo)題：Dissection of the Global Responses of Mandarin Fish Pyloric Caecum to An Acute Ranavirus (MRV) Infection Reveals the Formation of Serositis and Then Ascites

發(fā)表期刊：bioRxiv

物種樣本：鱖魚

測(cè)序策略：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、空間轉(zhuǎn)錄組(BMKMANU S1000)

DOI：https://doi.org/10.1101/2025.01.02.631049

發(fā)布時(shí)間：2025.01.02

百邁客生物為該研究提供了百創(chuàng)S1000空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)服務(wù)。

取樣策略：

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組：接種蛙虹彩病毒（MRV）和PBS 5天后的鱖魚的幽門盲囊組織（n=2）

空間轉(zhuǎn)錄組：感染蛙虹彩病毒（MRV）的鱖魚的幽門盲囊組織

① 鱖魚蛙病毒（MRV）作為大口黑鱸病毒（LMBV）的一種變體，屬于虹彩病毒科蛙病毒屬的一個(gè)獨(dú)特成員。急性MRV感染主要影響鱖魚的一個(gè)關(guān)鍵內(nèi)臟器官——幽門盲囊，并推測(cè)這是導(dǎo)致鱖魚出現(xiàn)嚴(yán)重腹水這一特征性外部臨床癥狀的驅(qū)動(dòng)因素。

② 該研究揭示，急性MRV感染最初靶向鱖魚幽門盲囊的漿膜層，并迅速發(fā)展為以漿膜肥厚、纖維化、充血、水腫和組織粘連為特征的纖維素性漿膜炎。通過單細(xì)胞RNA測(cè)序，研究人員分析了上皮、免疫和間質(zhì)細(xì)胞群的細(xì)胞組成，確定了巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞以及T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞作為急性細(xì)胞因子和炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵介體顯著富集。隨后，有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，MRV攻擊特定的T細(xì)胞和B細(xì)胞免疫細(xì)胞亞群以及成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞的間質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致增生性漿膜區(qū)的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）形成、膠原生物合成和血管重塑相關(guān)基因和途徑的上調(diào)。此外，宿主來源的V型膠原和MRV編碼的膠原均參與肥厚漿膜中ECM的形成。

③ 綜上所述，該研究提供了對(duì)鱖魚幽門盲囊對(duì)急性MRV感染的全面單細(xì)胞分辨率分析，并強(qiáng)調(diào)了病毒驅(qū)動(dòng)的漿膜炎是導(dǎo)致鱖魚嚴(yán)重腹水的根本原因。

圖7-受感染幽門盲囊單細(xì)胞的空間位置

文章標(biāo)題：Dural Tregs Driven by Astrocytic IL-33 Mitigate Depression Through the EGFR Signals in mPFC Neurons

期刊名稱：?Cell Death & Differentiation

影響因子：13.7

合作單位：南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系

研究對(duì)象：小鼠

百邁客生物為該研究提供了10X單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)服務(wù)。

研究背景

抑郁癥是一種常見的精神障礙，表現(xiàn)為長(zhǎng)時(shí)間情緒低落、失去快樂或?qū)顒?dòng)的興趣等，其表現(xiàn)不同于正常的情緒變化和對(duì)日常生活的感覺。抑郁癥具有發(fā)病率高、臨床治愈率也高，但治療接受率低、復(fù)發(fā)率高的特征，目前治療手段有限，約有30%患者接受一線抗抑郁藥物后癥狀無緩解，癥狀有緩解的部分患者會(huì)在首次治療后復(fù)發(fā)。因此，有必要深入研究認(rèn)識(shí)抑郁癥的生理病理致病機(jī)制，為開發(fā)更有效的治療手段提供見解。

材料及方法

材料：8周大C57BL/6雄性小鼠以及6個(gè)月大ICR小鼠，構(gòu)建慢性社交挫敗應(yīng)激（CSDS）模型。不同基因型小鼠（Il33-/-，Il1rl1-/-，Rag1-/-，F(xiàn)oxp3DTR）購(gòu)買后，培養(yǎng)1周后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

方法：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，免疫熒光，RT-PCR，ELISA，Western blot，流式細(xì)胞術(shù)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等。

研究結(jié)果

• 抑郁應(yīng)激誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)顯著的硬腦膜Treg擴(kuò)增

研究者首先構(gòu)建CSDS小鼠模型并經(jīng)過行為學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用流式細(xì)胞術(shù)等研究CSDS小鼠硬腦膜-腦界面免疫細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Treg（調(diào)節(jié)性T細(xì)胞）在硬腦膜而不是腦實(shí)質(zhì)中顯著增殖激活，fluoxetine（抗抑郁藥物）顯著激活硬腦膜Treg擴(kuò)增，這些結(jié)果暗示Treg可能在抑郁樣行為發(fā)展中起到重要作用，fluoxetine可能通過增加硬腦膜中的Treg減輕抑郁表現(xiàn)，調(diào)控硬腦膜Treg或許是治療抑郁的潛在靶點(diǎn)。

圖1-CSDS刺激顯著誘導(dǎo)了小鼠硬腦膜中Treg的浸潤(rùn)

• 定義硬腦膜Treg免疫表型

CSDS小鼠和對(duì)照組小鼠硬腦膜分選得到的免疫細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq，結(jié)果顯示CSDS小鼠硬腦膜T細(xì)胞占比增加，其中Treg和Th17比例增加，Th2比例降低，初始T細(xì)胞沒有發(fā)生變化；Treg中，Gata3+?Treg比例提高，初始Treg和Rorx+?Treg比例降低。對(duì)照組小鼠硬腦膜和脾臟分選得到Treg進(jìn)行SMART-seq，發(fā)現(xiàn)與脾臟相比，硬腦膜Treg的Gata3+亞型和Rora+亞型相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)。流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步證實(shí)CSDS小鼠硬腦膜中GATA3+?Treg顯著增加，RORγt+?Treg數(shù)量無顯著變化。這些表明GATA3+ Treg可能參與抑郁表現(xiàn)的調(diào)控。

圖2-CSDS刺激誘導(dǎo)小鼠硬腦膜中Treg浸潤(rùn)顯著增加

• IL33/ST2信號(hào)參與CSDS應(yīng)激后硬腦膜中Treg增加

SMART-seq數(shù)據(jù)顯示CSDS小鼠硬腦膜“IL33結(jié)合”以及其他內(nèi)源性分子結(jié)合信號(hào)通路表達(dá)上調(diào)；與脾臟相比，CSDS小鼠硬腦膜中表達(dá)ST2的細(xì)胞比例顯著高于脾臟；硬腦膜Treg富集趨化性通路。scRNA-seq數(shù)據(jù)也顯示CSDS小鼠模型中T淋巴細(xì)胞聚群高表達(dá)ST2編碼基因，且表達(dá)水平高于對(duì)照組小鼠的T淋巴細(xì)胞；CSDS小鼠模型硬腦膜Treg高表達(dá)ST2編碼基因。隨后，研究者將WT小鼠和Il1rl1-/-小鼠硬腦膜Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)移到Rag1-/-小鼠并構(gòu)建CSDS模型，行為學(xué)等實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，ST2表達(dá)是硬腦膜Treg招募和擴(kuò)張所必須的。IL33-/-小鼠相關(guān)實(shí)驗(yàn)也支持了IL33/ST2信號(hào)在抑郁期間促進(jìn)硬腦膜Treg增殖。

圖3-通過激活ST信號(hào)，抑郁應(yīng)激增強(qiáng)硬腦膜中Treg的浸潤(rùn)

圖4-CSDS應(yīng)激后，IL33/ST2信號(hào)可能參與硬腦膜Treg數(shù)量的增加

• mPFC星形細(xì)胞IL33介導(dǎo)了硬腦膜Treg的浸潤(rùn)

mPFC、海馬、腦脊液等組織的ELISA、qPCR以及Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CSDS小鼠硬腦膜ST2+ Treg激活所需的IL33來源于腦實(shí)質(zhì)而不是硬腦膜。多重免疫熒光結(jié)果表明mPFC處星形細(xì)胞是IL33增加的主要貢獻(xiàn)細(xì)胞類型。進(jìn)一步的特異性細(xì)胞類型IL33基因表達(dá)KO-恢復(fù)實(shí)驗(yàn)及相應(yīng)的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)等結(jié)果表明，主要是星形細(xì)胞來源的IL33介導(dǎo)了CSDS小鼠中硬腦膜Treg的產(chǎn)生。

圖5-抑郁應(yīng)激誘導(dǎo)腦星形細(xì)胞分泌的IL33可能參與硬腦膜Treg數(shù)量的增加

• 通過增強(qiáng)AREG分泌，硬腦膜Treg抵消了抑郁應(yīng)激

進(jìn)一步分析scRNA-seq數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞簇還顯著高表達(dá)Areg，流式細(xì)胞術(shù)、Western blot、免疫熒光等實(shí)驗(yàn)表明CSDS小鼠硬腦膜AREG分泌加強(qiáng)，mPFC區(qū)域AREG表達(dá)水平顯著降低。通過向CSDS應(yīng)激小鼠腦延髓注釋AREG的中和抗體并進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CSDS小鼠表現(xiàn)出更嚴(yán)重的抑郁行為。這些結(jié)果暗示來源于硬腦膜Treg的AREG可能是抑郁進(jìn)展中的主要中間物。

圖6-去除硬腦膜Treg加重了CSDS誘導(dǎo)的抑郁行為

• 硬腦膜Treg來源的AREG可以影響CSDS小鼠mPFC的錐體神經(jīng)元

腦免疫熒光掃描結(jié)果表明硬腦膜來源的AREG可能特異性的影響mPFC神經(jīng)元活性，TSA多重染色等實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CSDS應(yīng)激顯著誘導(dǎo)mPFC神經(jīng)元EGFR（AREG是EGFR配體）的表達(dá)，硬腦膜AREG去除可顯著抑制mPFC的EGFR激活，小腦延髓池注射的AREG中和抗體只去除了硬腦膜AREG但對(duì)mPFC腦區(qū)AREG無顯著影響。通過這些結(jié)果，研究者假設(shè)神經(jīng)元表達(dá)EGFR可以接收硬腦膜Treg來源的AREG，并激活EGFR信號(hào)，直接影響神經(jīng)元活性。

為了驗(yàn)證這一假設(shè)，研究者使用AAV抑制mPFC錐體神經(jīng)元EGFR的表達(dá)，免疫熒光、Western blot等實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲除EGFR部分地加重CSDS小鼠抑郁表現(xiàn)，應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁中mPFC神經(jīng)元EGFR信號(hào)起到重要作用，揭示mPFC錐體神經(jīng)元是硬腦膜Treg來源AREG的靶細(xì)胞。

隨后研究者使用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄CSDS小鼠mPFC錐體神經(jīng)元的微小興奮性突觸后電流（mEPSC），發(fā)現(xiàn)20ng/ml AREG條件下，錐體神經(jīng)元的mEPSC振幅顯著降低但頻率沒有變化，表明AREG可抑制AMPA受體功能，降低突觸后位點(diǎn)數(shù)量，進(jìn)一步降低EGFR+ 錐體神經(jīng)元的興奮性突觸傳遞。

綜上，研究者推測(cè)硬抑郁小鼠腦膜Treg來源的AREG可以通過抑制mPFC錐體神經(jīng)元的過度興奮，抵抗抑郁表現(xiàn)。

圖7-硬腦膜Treg分泌的AREG可能通過影響mPFC神經(jīng)元活性調(diào)控抑郁行為

圖8-通過激活mPFC錐體神經(jīng)元的EGFR信號(hào)，硬腦膜Treg調(diào)控抑郁行為

研究總結(jié)

本研究發(fā)現(xiàn)硬腦膜Treg在神經(jīng)響應(yīng)抑郁刺激中起到重要作用，硬腦膜Treg與mPFC神經(jīng)細(xì)胞通過AREG-EGFR交流，調(diào)控抑郁進(jìn)展。該發(fā)現(xiàn)表明硬腦膜Treg可作為減輕抑郁表型的靶點(diǎn)，為開發(fā)新型診療手段提供了不同思路。

文章標(biāo)題：Spatial transcriptome analysis reveals de novo regeneration of poplar roots

發(fā)表期刊：Horticulture Research

合作單位：北京大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究院

研究物種：楊樹

?技術(shù)策略：空間轉(zhuǎn)錄組（BMKMANU?S1000平臺(tái)）

楊樹，作為一種廣泛栽培的經(jīng)濟(jì)樹種，以其高效、快速的扦插繁殖方法廣受認(rèn)可。然而，要實(shí)現(xiàn)高效的扦插繁殖，根系的再生能力至關(guān)重要。沒有強(qiáng)大的根再生能力，扦插的枝條將難以成活，進(jìn)而影響到整個(gè)種植計(jì)劃的成功。盡管如此，目前關(guān)于根再生的研究主要集中在生長(zhǎng)素的調(diào)控作用上，對(duì)細(xì)胞分裂素的研究則相對(duì)較少。

空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)是一項(xiàng)新興的技術(shù)，它能夠在細(xì)胞水平上揭示基因表達(dá)的空間分布情況。這一技術(shù)的出現(xiàn)，為我們理解基因如何在特定的空間背景下調(diào)控生物過程提供了全新的工具。該研究利用這一技術(shù)，構(gòu)建了楊樹根再生過程的空間轉(zhuǎn)錄組圖譜，并深入探討了細(xì)胞分裂素在根再生中的關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，在楊樹根再生過程中，激素在協(xié)調(diào)植物生長(zhǎng)發(fā)育的復(fù)雜過程中起著關(guān)鍵作用，細(xì)胞分裂素響應(yīng)基因的表達(dá)貫穿整個(gè)發(fā)育過程。并且這些細(xì)胞分裂素響應(yīng)基因的啟動(dòng)子中普遍存在生長(zhǎng)素響應(yīng)順式作用元件（AuxREs），表明了生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素在調(diào)控根再生過程中的協(xié)同作用。為了更好地理解楊樹根再生過程中細(xì)胞的分化路徑，研究團(tuán)隊(duì)采用了擬時(shí)序軌跡分析方法，成功繪制了從形成層細(xì)胞到根原基細(xì)胞的分化路徑，展示了細(xì)胞分化的復(fù)雜性和動(dòng)態(tài)性。同時(shí)，研究還發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)潛在關(guān)鍵基因SAC56和LOS1，它們有望為未來增強(qiáng)植物根系再生提供新的解決方案和思路。

總的來說，這項(xiàng)研究通過空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，為植物根再生研究提供了新的思路，為我們深入理解植物再生的分子機(jī)制提供了新的視角和啟示。

圖1-建立楊樹根再生的空間轉(zhuǎn)錄組圖譜

圖2-不定根發(fā)育過程中的空間轉(zhuǎn)錄組分析揭示了激素基因表達(dá)的區(qū)域分布特征

期刊名稱：cell proliferation.

影響因子：5.9

合作單位：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院

研究部位：大鼠胚胎

研究方法：空間轉(zhuǎn)錄組、免疫熒光、CCK-8、WB、ROS檢測(cè)等

百邁客生物為該研究提供了空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序服務(wù)。

研究背景

肛門直腸畸形 （ARM） 是兒童常見的先天性消化道畸形，發(fā)病率為 1/5000。ARM 的病因仍然難以捉摸，其發(fā)病機(jī)制與遺傳和環(huán)境因素有關(guān)。最近的研究強(qiáng)調(diào)了遺傳調(diào)控在這一過程中的關(guān)鍵作用。ARM 通常發(fā)生在妊娠 4-8 周，主要在出生后診斷，通常需要手術(shù)干預(yù)作為治療。然而，ARM 患者的長(zhǎng)期術(shù)后結(jié)局并不理想，通常會(huì)導(dǎo)致并發(fā)癥，例如大便失禁和慢性便秘。這些并發(fā)癥對(duì)受影響兒童的生活質(zhì)量和社會(huì)心理發(fā)展有重大影響。作者的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析確定了鐵死亡的發(fā)生，這是一種鐵依賴性的程序性細(xì)胞死亡，其特征是活性氧 （ROS） 和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物在 ARM 后腸內(nèi)積累。作者假設(shè)這個(gè)過程受活化 C 激酶受體 1 （Rack1） 的調(diào)節(jié)，細(xì)胞質(zhì)蛋白與鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白有相似之處。它在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、信號(hào)傳導(dǎo)和免疫反應(yīng)中發(fā)揮著多種作用，并且在胚胎神經(jīng)發(fā)育中具有潛在的意義。然而，以前的研究沒有報(bào)道 Rack1 在鐵死亡調(diào)節(jié)中的作用。因此，它在胚胎消化道發(fā)育和 ARM 形成中的作用需要進(jìn)一步探索。

材料方法

使用Wistar 大鼠，在 ARM 組中，大鼠在 GD 10開始口服 1% ETU 125 mL/kg，對(duì)照組接受等劑量生理鹽水。從 GDs 14-16取胚胎。

1、空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序剖宮產(chǎn)后，立即將取出的胚胎置于冷生理鹽水中以去除表面血。將胚胎以水平矢狀方向放置在含有預(yù)冷OCT的包埋盒中儲(chǔ)存在 -80°C 冰箱中。共計(jì)6份樣品，切片包括尿道和后腸層。2、免疫熒光

選擇清晰全面顯示尿道、后腸、URS 和尿道回瘺的石蠟切片進(jìn)行染色。

研究結(jié)果

1.空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的注釋聚類

在這項(xiàng)研究中，作者在 GDs 14-16 （稱為 N14-16） 上使用正常的 Wistar 大鼠胚胎，在 GDs 14-16 （稱為 A14-16） 上使用 ETU 誘導(dǎo)的 ARM 胚胎進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。制備大鼠胚胎的 6 個(gè)冷凍中矢狀切片，每個(gè) 10 μm 厚。這些切片包括尿道和后腸層，提供了特定時(shí)間點(diǎn)泄殖腔發(fā)育的全面視圖（圖 1A）。使用 10× Genomics Visium 空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，然后進(jìn)行組織透化、cDNA 合成和文庫(kù)構(gòu)建，作者成功地捕獲了正常和 ARM 胚胎中的視覺基因轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)，主要來自泄殖腔區(qū)域。為了確保來自同一區(qū)域的各種切片樣本之間的可比性和一致性，作者進(jìn)行了聚類注釋，產(chǎn)生了七個(gè)不同的聚類。這些集群包括泄殖腔區(qū)域內(nèi)的五個(gè)特定區(qū)域（集群 0-4），即尿道、后腸、膀胱、URS 和生殖器結(jié)節(jié)。此外，兩個(gè)簇 （簇 5 和 6） 對(duì)應(yīng)于椎體和神經(jīng)管區(qū)域 （圖 1A）。平均而言，每個(gè)解剖區(qū)域覆蓋 3005 個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)捕獲 16,905 個(gè)基因（圖 1B）。

圖1-空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的注釋聚類

2.正常組和 ARM 組之間的 DEG 篩選

鑒定 DEG 的標(biāo)準(zhǔn)被確定為絕對(duì)對(duì)數(shù)2 倍變化 （|log2FC|） ≥ 0.58 且顯著性水平為 p< 0.05. 這種篩選導(dǎo)致了差異火山圖的創(chuàng)建，以說明基因表達(dá)的改變。在 GDs 14、15 和 16 的后腸發(fā)育背景下，作者分別鑒定了 91、439 和 119 個(gè)基因，它們?cè)谶@些時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)出不同的表達(dá)譜（圖 1C）。值得注意的是，Rack1 （Gnb2l1） 在 GDs 15 和 16 上在 ARM 組后腸內(nèi)的表達(dá)降低。為了進(jìn)一步探索潛在的分子相互作用，作者進(jìn)行了全面的 PPI 分析。通過利用 BC 值作為排名標(biāo)準(zhǔn)，作者突出了最顯著的差異表達(dá)后腸基因（圖 1D）。樞紐基因，在環(huán)狀排列中用粉紅色節(jié)點(diǎn)表示，包括 Uba52、Rack1 和 Tpt1，在后腸發(fā)育的 GDs 15 和 16 期間，每個(gè)基因在基因網(wǎng)絡(luò)中都具有顯著的中心性。值得注意的是，Rack1 表現(xiàn)出卓越的連通性，在 GD 15 和 16 的 PPI 網(wǎng)絡(luò)中躋身前五名基因之列。

3.在 GD 15 上驗(yàn)證后腸部分 DEGs

圖 2A-E 全面說明了 GD15 截面泄殖腔區(qū)域中前五個(gè)基因的蛋白質(zhì)表達(dá)模式和定位：Rack1、Npm1、Eef1b2、Uba52?和?Tpt1。這些數(shù)字是使用免疫熒光染色獲得的。值得注意的是，這 5 種蛋白質(zhì)在 N15 泄殖腔區(qū)域的尿道和后腸上皮內(nèi)均表現(xiàn)出位點(diǎn)特異性表達(dá)。除?Tpt1?外，其他 4 種蛋白在 AM 區(qū)域內(nèi)表現(xiàn)出表達(dá)水平升高。此外，觀察到這些蛋白質(zhì)離散分布在 URS 的下肢和后腸的間質(zhì)附近。相比之下，這五種蛋白的表達(dá)在 A15 泄殖腔區(qū)域的尿道和后腸上皮內(nèi)明顯下降，伴隨著尿道直瘺部位的表達(dá)水平降低 （p < 0.05）。圖 2F 顯示了平均光密度 （AOD） 的半定量評(píng)估，特別是在后腸結(jié)構(gòu)域內(nèi)。

圖2-在 GD 15 上驗(yàn)證后腸部分 DEGs

4.PROGENy 算法預(yù)測(cè)后腸中 MAPK 信號(hào)通路的集中富集

PROGENy 算法用于通過下游基因表達(dá)的變化評(píng)估信號(hào)通路的活性。作者獲得了正常組和 ARM 組 GDs 14-16 樣本中不同通路的活性水平評(píng)分。在使用 NNMF 對(duì)后腸區(qū)域（N14 因子 16、A14 因子 15、N15 因子 15、A15 因子 20、N16 因子 18 和 A16 因子 10）進(jìn)行聚類分析中，PROGENy 算法顯示與 MAPK 信號(hào)通路呈強(qiáng)正相關(guān)，表明 MAPK 信號(hào)在后腸中顯著富集（圖 3A)。從這些區(qū)域提取來自 Erk、P38、JNK 和 Erk5 家族的 12 個(gè)成員分子的定位表達(dá)模式。具體來說，Mapk3 、 Mapk6 和 Mapk14 主要富集在泄殖腔區(qū)域。這些蛋白質(zhì)的免疫熒光驗(yàn)證證實(shí)了它們?cè)谀虻篮秃竽c區(qū)域的特異性表達(dá)，在 URS 和間質(zhì)區(qū)域的表達(dá)相對(duì)較弱，這與 PROGENy 預(yù)測(cè)一致（圖 3B）。

圖3-PROGENy 算法預(yù)測(cè)后腸中 MAPK 信號(hào)通路的集中富集用

5.通過細(xì)胞死亡基因定位探索 Gpx4 的時(shí)空表達(dá)模式

在基因集富集分析（GSEA）數(shù)據(jù)庫(kù)中，細(xì)胞死亡基因集包含161個(gè)基因，其中 7 個(gè)細(xì)胞死亡相關(guān)基因是從基因集與GD 15上簇1中的 DEGs 交集中獲得的（圖 4A）。圓形熱圖顯示了與聚類1的6個(gè)樣本相同區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞死亡基因的表達(dá)譜。值得注意的是，發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽過氧化物酶家族的關(guān)鍵成員?Gpx4?在 GD 15 的簇 1 中下調(diào)（p < 0.05；圖 4B）。免疫熒光染色顯示 Gpx4 蛋白在尿道和后腸上皮以及 AM 區(qū)域的顯著定位，在 URS 中觀察到的分布相對(duì)較淺。在 ARM 組的泄殖腔中觀察到 Gpx4 陽(yáng)性信號(hào)的減少（圖 4C）。AOD 分析表明，在 GDs 15 和 16 上，后腸中 Gpx4 表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著降低（p < 0.05;圖 4D）。

圖4-通過細(xì)胞死亡基因定位探索 Gpx4 的時(shí)空表達(dá)模式

6.PD-L2 過表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞凋亡并促進(jìn)對(duì) EGFR-TKI 的耐藥

N15 胚胎石蠟切片的雙免疫熒光染色顯示 Rack1 和 Gpx4 蛋白在尿道和后腸上皮內(nèi)共定位。該結(jié)果表明 Rack1 在調(diào)節(jié)這些組織中的鐵死亡中的潛在作用 （圖 4E）。隨后，進(jìn)行顯微解剖以獲得正常和 ARM 胚胎的后腸組織。透射電子顯微鏡 （TEM） 顯示 ARM 組細(xì)胞線粒體體積減小，線粒體密度增加，線粒體嵴減少。這些觀察結(jié)果與與鐵死亡發(fā)生相關(guān)的線粒體形態(tài)變化一致（圖 4F）。

7.Rack1 在 GDs 14 和 16 上的時(shí)空表達(dá)譜

之前描述了 Rack1 蛋白在 GD 15 泄殖腔區(qū)的定位（圖 2A），作者進(jìn)一步研究了它在 GDs 14 和 16 泄殖腔區(qū)的定位。在正常胚胎 （N14） 中，Rack1 陽(yáng)性信號(hào)主要在尿道和后腸的上皮細(xì)胞中觀察到，后腸遠(yuǎn)端的濃度較高。這些信號(hào)也分散在 URS 和間充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)。在 ARM 胚胎 （A14） 中，在 URS 尖端、后腸和尿道上皮觀察到 Rack1 陽(yáng)性細(xì)胞（圖 5A）。比較分析顯示，N14 和 A14 組之間 Rack1 陽(yáng)性信號(hào)的 AOD 沒有顯著差異（圖 5B）。在 GD 16 （N16） 的正常大鼠胚胎中，Rack1 表達(dá)在尿道和后腸上皮中仍然突出，但在 URS 和周圍間充質(zhì)區(qū)域受到限制（圖 5A）。值得注意的是，A16 后腸區(qū)域的熒光強(qiáng)度降低 （p < 0.05），如圖 5B 所示，這說明了后腸區(qū)域的半定量 AOD 結(jié)果。

圖5-Rack1 在 GDs 14 和 16 上的時(shí)空表達(dá)譜

8.敲低 Rack1 誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞鐵死亡

在 IEC-6 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 si-Rack1 后，使用 TEM 觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。si-Rack1 組表現(xiàn)出完整的細(xì)胞和核膜，線粒體大小減小，線粒體密度增加。此外，線粒體嵴減少或不存在，類似于 erastin 處理后觀察到的特征（圖 5C）。如 CCK-8 測(cè)定中觀察到的 Rack1 敲低導(dǎo)致細(xì)胞活力降低，LDH 測(cè)定所示，細(xì)胞毒性增加（p < 0.05；圖 5D）。使用 FerroOrange 探針的熒光分析表明 si-Rack1 組細(xì)胞內(nèi)亞鐵離子濃度升高，在 Fer-1 處理后降低（p < 0.05；圖 5E）。使用 DCFH-DA 探針測(cè)量細(xì)胞內(nèi) ROS 水平顯示 si-Rack1 組的 ROS 水平較高，在 Fer-1 處理后下降（p < 0.05；圖 5F）。Liperfluo 探針評(píng)估揭示了 Fer-1 能夠減輕 si-Rack1 組中升高的脂質(zhì)過氧化物水平 （p < 0.05；圖 5G）。熒光強(qiáng)度定量結(jié)果如右圖所示。

9.Rack1 敲低可增強(qiáng) P38 磷酸化并調(diào)節(jié)下游 Nqo1/Gpx4 表達(dá)

如前所述，MAPK 信號(hào)通路在后腸區(qū)域顯著富集（圖 3A）。在 IEC-6 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 si-Rack1 后，使用 MAPK 信號(hào)通路 PCR 陣列在 mRNA 水平上鑒定受 Rack1 影響的下游分子。使用閾值 |log2FC|≥ 2 和 p < 0.05 用于 PCR 陣列差異基因篩選，作者觀察到 si-Rack1 組中 P38δ （Mapk13 encoding） 的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著升高（圖 6A、B）。Western blot 分析顯示，Rack1 敲低后磷酸化 P38 水平增加（圖 6C、D），表明對(duì) Rack1 的干擾增強(qiáng)了 P38 磷酸化，從而激活了 IEC-6 細(xì)胞中的 P38-MAPK 信號(hào)通路。隨后，使用鐵死亡 PCR 陣列篩選 si-Rack1 和 doramapimod 處理組之間表現(xiàn)出 mRNA 水平變化的基因，揭示了總共 7 個(gè)基因（圖 6E）。此外，這 7 個(gè)基因的表達(dá)豐度數(shù)據(jù)與現(xiàn)有研究報(bào)告相結(jié)合，將 Nqo1 確定為下游分子，以供進(jìn)一步研究。Western blotting 分析顯示，doramapimod 處理逆轉(zhuǎn)了 Rack1 敲除誘導(dǎo)的 Nqo1 蛋白水平降低（圖 6F）。此外，在 si-Rack1 組中觀察到的 Gpx4 降低被 doramapimod 抑制，并通過 2-HBA 處理恢復(fù)（圖 6G）。

圖6-Rack1 敲低可增強(qiáng) P38 磷酸化并調(diào)節(jié)下游 Nqo1/Gpx4 表達(dá)

10.Rack1?通過 P38 和 Nqo1 介導(dǎo)腸上皮細(xì)胞中的鐵死亡

在 IEC-6 細(xì)胞敲低 Rack1 的同時(shí)，使用 doramapimod 和 2-HBA 進(jìn)行拯救實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，與單獨(dú)的 Rack1 敲低相比，添加 doramapimod 和 2-HBA 導(dǎo)致細(xì)胞活力增加和相對(duì) LDH 含量降低 （p < 0.05；圖 6H，I）。此外，在添加 doramapimod 和 2-HBA 后，細(xì)胞內(nèi)亞鐵離子濃度降低，同時(shí) ROS 和脂質(zhì)過氧化水平降低（p < 0.05；圖 6J-L）。這些發(fā)現(xiàn)表明，Rack1 通過P38信號(hào)通路和 Nqo1 調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鐵含量和脂質(zhì)過氧化，從而介導(dǎo)腸上皮細(xì)胞的鐵死亡。

研究總結(jié)

本研究利用空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對(duì) GDs 14-16 期間的正常和 ARM 大鼠胚胎樣本進(jìn)行測(cè)序。作者在后腸區(qū)域鑒定了具有高連接性的新樞紐基因，即?Rack1 、 Uba52 、 Tpt1 、 Npm1?和?Eef1b2。相比之下，作者觀察到 MAPK 信號(hào)通路的顯著富集和 Gpx4 在后腸區(qū)域的差異表達(dá)。值得注意的是，Rack1?在 GDs 15 和 16 的 ARM 后腸中表達(dá)降低，通過 P38/Nqo1/Gpx4 軸升高細(xì)胞內(nèi)鐵、ROS 和脂質(zhì)過氧化水平，最終誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞鐵死亡，并可能影響 ARM 后腸發(fā)育。這些發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)了作者對(duì) ARM 發(fā)病機(jī)制的理解，并對(duì)推進(jìn) ARM 產(chǎn)前診斷和治療策略的研究具有重要意義。